Name: laser microdissection applied to gene expression profiling of subset of cells from the drosophila wing disc
Uploaded: 2010-04-30T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Os autores agradecem a prof. Chiara Campanella e AMRA Centro de Competência da Universidade de Nápoles Federico II, Nápoles, Itália, para proporcionar-lhes o uso do microdissector laser, e Vincenzo Vicidomini ajuda generosa na animação 3D.

Parte 1. Preparação de discos Drosophila Asa Imaginal Sujeitos a RNAi específica e localizada. Como material biológico, foram utilizados discos de Drosophila asa imaginal obtido a partir de larvas transgênicas submetidas ao silenciamento de genes localizados e específicos, por meio do sistema GAL4/UAS 1. Esta progênie larval orginates de um cruzamento genético envolvendo duas linhas parentais: uma carregando o driver GAL4, o segundo a responder UAS. Além d...

<ol>
	<li>Elliott, D. A., Brand, A. H., Dahmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GAL4+System+A+Versatile+System+for+the+Expression+of+Gene.">The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene.</a> , (2008).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.+.">Wing disc development in the fly: the early stages. .</a> Current Opinion in Genetics &#38; Development. 11, 470-475 (2001).</li><li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).</li><li>Martin, F. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+the+control+of+growth+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 133, 4421-4426 (2006).</li><li>Tabata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+morphogen+gradients.">Genetics of morphogen gradients.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).</li><li>Moreno, E. &. a. m. p. ;. a. m. p., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dMyc+transforms+cells+into+super-competitors.">dMyc transforms cells into super-competitors.</a> Cell. 117, 117-129 (2004).</li></ol>

Em relação aos seus níveis de expressão basal alcançado nos compartimentos anterior / posterior da asa unsilenced discos, a atividade do gene X selecionada foi encontrado reduzidos para 40% sobre o silenciamento. Em contraste, um dos seus alvos putativos (genes Y) foi encontrada significativamente sobre-regulada (7 vezes maior), levando-nos para validar a hipótese de que ela foi regulada negativamente pelo gene X. Concluímos que a abordagem acima descrita experimental pode ser aplicad...

Fly cepas Drosophila UAS silenciando-linhas podem ser obtidas VDRC RNAi coleção de 2. Uma coleção de GAL4 driver-linhas está disponível no Drosophila Bloomington stock Center (Indiana, EUA). Equipamento Equipamentos necessários inclui Laser microdissector (Leica LMD6000), Coulter Microcentrifugue 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD My Cycler), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5). Ferramentas Ferramentas necessárias incluem: poços de vidro, escova, pinça de microdissecção, slides gotas de suspensão, alfinetes de insetos montados em agulhas de seringa, armações de metal com membrana PET, tubos de plástico (50 ml, 05 ml, 0,25 ml).

laser microdissection applied to gene expression profiling of subset of cells from the drosophila wing disc

Heterogeneidade de tecidos tem provado ser um fator limitante na quantidade de informações que podem ser gerados a partir de amostras biológicas, comprometendo análises a jusante. Considerando-se as associações complexas e dinâmicas celulares existentes dentro muitos tecidos, a fim de recapitular a nas interações vivo análise minuciosa molecular é preciso ser capaz de analisar populações de células específicas dentro de seu contexto nativo. Laser mediada por microdissecção pode alcançar este objetivo, permitindo uma identificação inequívoca e colheita bem-sucedida de células de interesse sob visualização microscópica direta, mantendo a integridade molecular. Temos aplicado esta tecnologia para analisar a expressão de gene dentro das áreas definidas do desenvolvimento de Drosophila disco asa, o que representa um sistema modelo para estudar vantajoso controlar o crescimento, diferenciação celular e organogênese. Larval discos imaginais são precocemente subdividida em compartimentos anterior e posterior, dorsal e ventral por fronteiras restrição linhagem. Fazendo uso da induzível GAL4-UAS sistema de expressão de binário, cada um desses compartimentos podem ser rotulados especificamente em moscas transgênicos expressando um transgene UAS-GFP sob o controle do driver apropriado GAL4 construir. Nos discos transgênicos, perfil de expressão gênica de subconjuntos discretos de células pode ser determinada precisamente após laser-mediada microdissecção, usando o sinal fluorescente GFP para guia de corte a laser. Entre a variedade de aplicações a jusante, nos concentramos em RNA perfil transcrição localizada após interferência de RNA (RNAi). Com o advento da tecnologia de RNAi, GFP rotulagem podem ser acoplados com knockdown localizada de um determinado gene, o que permite determinar a resposta transcricional de uma população de células discretas para o silenciamento de genes específicos. Para validar esta abordagem, dissecamos áreas equivalentes do disco do posterior (rotulada pela expressão GFP), eo compartimento (sem identificação) anterior ao silenciamento regionais no compartimento de P de um gene de outra forma ubiquitously expressa. RNA foi extraído de microdissecção áreas silenciadas e unsilenced e perfil de expressão gênica comparativa determinado pelo quantitativo em tempo real, RT-PCR. Nós mostramos que este método pode ser aplicado de forma eficaz para transcriptômica precisa de subconjuntos de células dentro dos discos Drosophila imaginal. De fato, enquanto a preparação do disco massivo como fonte de RNA geralmente assume homogeneidade celular, é bem sabido que a expressão transcricional pode variar muito dentro dessas estruturas em conseqüência da informação posicional. Usando o sinal fluorescente GFP localizada a guia de corte a laser, mais precisas análises de transcrição pode ser realizada e rentável aplicado a diferentes aplicativos, incluindo perfis de transcrição de linhagens celulares distintas dentro de seu contexto nativo.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Microdissecção a laser foi aplicado para analisar perfil de expressão gênica em compartimentos específicos de Drosophila disco asa submetido a RNAi localizada<em&gt; In vivo</em&gt;. RNA extraído de áreas equivalentes de compartimentos silenciadas e unsilenced foi analisado por RT-PCR quantitativa para determinar perfis de expressão gênica comparativa no contexto da microecologia tecido nativo.

Microdissecção a laser Aplicada ao perfil de expressão gênica de subconjunto de células a partir do Drosophila Asa Disco

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser Microdissecção Captura de tecidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...