Name: pulse-chase analysis of n-linked sugar chains from glycoproteins in mammalian cells
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells at JoVE.com

हम तकनीकी सहायता के लिए Zehavit Frenkel और सैंड्रा Tolchinsky धन्यवाद. इस काम से संबंधित अनुसंधान के इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (1229-1207) और जर्मन इजरायल परियोजना सहयोग (डुबकी DFG) से अनुदान द्वारा समर्थित है.

कुल glycoproteins या ब्याज की एक विशिष्ट ग्लाइकोप्रोटीन के चीनी श्रृंखला के विश्लेषण के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का इरादा है. प्रक्रिया मूल रूप से के रूप में प्रोटोकॉल भर में कहा कुछ परिवर्तन के साथ दोनों ही म...

<ol>
	<li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver.">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li><li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+(ER)+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation.">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li><li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2.">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li><li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+(ER)+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I.">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li><li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure.">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li><li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide.">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li></ol>

नाड़ी पीछा HPLC जुदाई के साथ जीवित कोशिकाओं में glycans का विश्लेषण एक glycoprotein के जीवन भर oligosaccharide संरचनात्मक परिवर्तन की गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक तरीका प्रदान करता है. वहाँ बढ़ती सबूत है कि इस तरह के परिवर्तन ई?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>600E Multisolvent delivery System controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT062710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck Bioscience</td>
<td>1.0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC503024 or 4208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5301 000.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialyzed Foetal Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-011-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen Cell Culture</td>
<td>41965039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium - glucose free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D5030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D1408</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA disodium salt (Titriplex Iii)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1084180250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>p0703S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal Calf Serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-001-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Frac-100 fraction collector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>18-1000-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>510720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>NET570A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>474790</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-glycosidase F (1000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11365177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>O3757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
<td>CRL-1658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Opti-Flour</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>6013199</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>79607</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2714</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A-Sepharose beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Repligen</td>
<td>IPA300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium deoxycholate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>30970</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-RAD</td>
<td>161-0301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium phosphate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>342483</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spherisorb NH2 Column, 5 &mu;m, 4.6 x 250 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>PSS831115</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BDH</td>
<td>306324N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sonics and Materials, Inc.</td>
<td>690-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 stably expressing H2a 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M3148</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

pulse-chase analysis of n-linked sugar chains from glycoproteins in mammalian cells

GLC की कुर्की<sub&gt; 3</sub&gt; मनुष्य<sub9&gt;</sub&gt; GlcNAc<sub2&gt;</sub&gt; ईआर में नवजात polypeptides oligosaccharide अग्रदूत स्रावी प्रोटीन के लिए एक आम संशोधन है. हालांकि इस संशोधन कई जैविक प्रक्रियाओं में फंसा था, अपने कार्य के अतिरिक्त पहलुओं, ग्लाइकोप्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण और अवैध व्यापार के लिए संकेतों के उत्पादन में अपनी भूमिका के हाल ही में सबूत के साथ उभर रहे हैं. इस प्रकार, एन जुड़े glycans और उनके प्रसंस्करण से संबंधित घटना अधिकता जांच की जा रही हैं. तरीके है कि हाल ही में प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है बहुत ग्लाइकोप्रोटीन एन से जुड़े glycans के लक्षण वर्णन में सुधार हुआ है. फिर भी, वे चीनी श्रृंखला शामिल प्रसंस्करण की गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते. इस के लिए, लेबलिंग और नाड़ी पीछा विश्लेषण प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया जाता है कि आम तौर पर जटिल हैं और बहुत कम पैदावार दे. हम यहाँ अलगाव और metabolically लेबल एन से जुड़े oligosaccharides के विश्लेषण के लिए एक सरल विधि का वर्णन. 2 [के साथ कोशिकाओं की लेबलिंग प्रोटोकॉल पर आधारित है -<sup&gt; 3</sup&gt; एच] mannose, denaturing और या तो ब्याज की एक विशेष रूप से immunoprecipitated प्रोटीन से या एंडो एच और एन glycosidase एफ के साथ अनुक्रमिक उपचार, आणविक निस्पंदन (Amicon) द्वारा पीछा द्वारा सामान्य ग्लाइकोप्रोटीन पूल से oligosaccharides के enzymatic रिलीज lysis. इस विधि में पृथक oligosaccharides HPLC विश्लेषण, जो monosaccharide उन्हें शामिल इकाइयों की संख्या के अनुसार विभिन्न glycan संरचनाओं के बीच भेदभाव की अनुमति देता है के लिए एक इनपुट के रूप में एक एकल monosaccharide के एक संकल्प के साथ सेवा. इस पद्धति का उपयोग करके हम सामान्य परिस्थितियों में नाड़ी - पीछा के बाद और एंटीबॉडी निषेध के तहत उच्च कुल सेल glycoproteins की mannose एन से जुड़े oligosaccharide प्रोफाइल का अध्ययन करने में सक्षम थे. इन प्रोफाइल एक immunoprecipitated गिरावट ईआर जुड़े सब्सट्रेट (ERAD) से प्राप्त उन लोगों के लिए तुलना में थे. हमारे परिणाम बताते हैं कि सबसे एनआईएच 3T3 सेलुलर glycoproteins अपेक्षाकृत स्थिर हैं और है कि उनके oligosaccharides के सबसे मनुष्य के लिए छंटनी कर रहे हैं<sub9-8&gt;</sub&gt; GlcNAc<sub2&gt;</sub&gt;. इसके विपरीत, अस्थिर ERAD substrates मैन छंटनी करने के लिए कर रहे हैं<sub6-5&gt;</sub&gt; GlcNAc<sub2&gt;</sub&gt; और इन प्रजातियों असर glycoproteins proteasomal गिरावट के निषेध पर जमा.

Watch this Scientific Journal Video about Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells at JoVE.com

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

हम एन जुड़े glycans के स्तनधारी कोशिकाओं में अपने biosynthesis के बाद glycoproteins के प्रारंभिक जीवन के माध्यम से परिवर्तन के विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन. यह नाड़ी पीछा metabolically लेबल glycans, glycoproteins और HPLC द्वारा परीक्षा से enzymatic रिलीज के विश्लेषण के द्वारा हासिल की है.

स्तनधारी कक्ष में glycoproteins से पल्स पीछा एन जुड़े चीनी चेन का विश्लेषण

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

आरएनएआई स्क्रीनिंग के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में मिशन esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis और आयन चैनल के कार्यात्मक विश्लेषण Heterologously स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

MRNA परमाणु निर्यात कैनेटीक्स के Microinjection द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

सेल चक्र स्थिति के स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

स्तनधारी Linker histone subtypes की अभिव्यक्ति विश्लेषण

Linker histone H1 binds to the nucleosome core particle and linker DNA, facilitating folding of chromatin into higher order structure.  H1 is essential ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में endoplasmic जालिका स्थानीयकृत mRNAs का विज़ुअलाइज़ेशन

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mesenchymal संक्रमण के लिए प्रेरण और उपकला का विश्लेषण

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में हीम संश्लेषण स्तर की माप

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में व्यापक समानांतर रिपोर्टर Assays

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...