Name: pulse-chase analysis of n-linked sugar chains from glycoproteins in mammalian cells
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00
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Agradecemos a Zehavit Frenkel e Sandra Tolchinsky para assistência técnica. Pesquisas relacionadas a este trabalho é suportado por concessões do Ciência Israel Foundation (1229-1207) eo alemão-israelense Projeto de Cooperação (DIP DFG).

O seguinte protocolo destina-se a análise de cadeias de açúcar de glicoproteínas total ou de uma glicoproteína específica de interesse. O procedimento é basicamente o mesmo para ambos os casos, com algumas alterações como indicado ao longo do protocolo. <ol><li> Para a rotulagem metabólica de N-glicanos ligados a pessoa precisa usar uma cultura confluentes de células de mamíferos cultivadas durante a noite em um prato de 90 mm para cada amostra (amostras podem representar diferentes momentos ou tratament...

<ol>
	<li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver.">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li><li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+(ER)+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation.">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li><li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2.">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li><li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+(ER)+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I.">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li><li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure.">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li><li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide.">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li></ol>

A análise do pulso-chase dos glicanos em células vivas, com separação por HPLC fornece um método para estudar a dinâmica do oligossacarídeo alterações estruturais ao longo da vida de uma glicoproteína. Há evidências crescentes de que tais alterações estão envolvidos na produção dos sinais de ER dobrar, controle de qualidade e 2-5 sistemas tráfico. O método pode ser aplicado não só para uma glicoproteína específica de interesse, mas também para analisar a dinâmica da estrutura de glico...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>600E Multisolvent delivery System controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT062710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck Bioscience</td>
<td>1.0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC503024 or 4208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5301 000.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialyzed Foetal Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-011-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Invitrogen Cell Culture</td>
<td>41965039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modi&#xFB01;ed Eagle's Medium - glucose free</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D5030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D1408</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA disodium salt (Titriplex Iii)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1084180250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>p0703S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal Calf Serum (FCS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>04-001-1A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Frac-100 fraction collector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>18-1000-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>510720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>NET570A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>474790</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-glycosidase F (1000 units/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11365177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>O3757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
<td>CRL-1658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Opti-Flour</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer Life Sciences</td>
<td>6013199</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>79607</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P2714</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A-Sepharose beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Repligen</td>
<td>IPA300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium deoxycholate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>30970</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-RAD</td>
<td>161-0301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium phosphate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>342483</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium pyruvate solution (100mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8636</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spherisorb NH2 Column, 5 &mu;m, 4.6 x 250 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>PSS831115</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BDH</td>
<td>306324N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sonics and Materials, Inc.</td>
<td>690-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH 3T3 stably expressing H2a 6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate, 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercaptoethanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M3148</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

pulse-chase analysis of n-linked sugar chains from glycoproteins in mammalian cells

Fixação do Glc<sub&gt; 3</sub&gt; Homem<sub&gt; 9</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; Precursor oligossacarídeo de polipeptídeos nascentes na ER é uma modificação comum para proteínas secretoras. Embora esta modificação foi implicado em vários processos biológicos, os aspectos adicionais de sua função estão surgindo, com a evidência recente de seu papel na produção de sinais para o controle de qualidade e glicoproteína tráfico. Assim, os fenômenos relacionados com a N-glicanos ligados e seu processamento estão sendo intensamente investigadas. Métodos que têm sido recentemente desenvolvidos para a análise proteômica têm melhorado bastante a caracterização da glicoproteína N-glicanos ligados. No entanto, eles não fornecem insights sobre a dinâmica da cadeia de processamento de açúcar envolvidos. Para isso, rotulagem e protocolos de pulso-chase análise são usados ​​que normalmente são complexos e dão rendimentos muito baixos. Descrevemos aqui um método simples para o isolamento e análise de metabolicamente marcados N-linked oligossacarídeos. O protocolo baseia-se na marcação das células com [2 -<sup&gt; 3</sup&gt; H] lise, desnaturação manose e liberação enzimática do oligossacarídeos a partir de qualquer uma proteína específica immunoprecipitated de interesse ou da piscina glicoproteína geral por meio de tratamentos seqüenciais com endo H e N-glicosidase F, seguido de filtração molecular (Amicon). Neste método, os oligossacarídeos isolados servir como insumo para HPLC análise, que permite a discriminação entre as várias estruturas glicano acordo com o número de unidades de monossacarídeo composto por eles, com uma resolução de um monossacarídeo único. Usando este método conseguimos estudar alta manose N-linked perfis de oligossacarídeos de glicoproteínas total de células após o pulso-chase em condições normais e sob inibição do proteassoma. Esses perfis foram comparados com aqueles obtidos a partir de uma ER associada à degradação do substrato immunoprecipitated (ERAD). Nossos resultados sugerem que a maioria dos NIH 3T3 glicoproteínas celulares são relativamente estáveis ​​e que a maioria de seus oligossacarídeos são aparados para Homem<sub&gt; 08/09</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt;. Em contraste, substratos ERAD instáveis ​​são aparados para Homem<sub&gt; 05/06</sub&gt; GlcNAc<sub&gt; 2</sub&gt; E glicoproteínas tendo estas espécies se acumulam sobre a inibição da degradação proteosomal.

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Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Nós descrevemos um método para análise da alteração da N-glicanos ligados através do início da vida de glicoproteínas após a sua biossíntese em células de mamíferos. Isto é conseguido através de pulso-chase análise de glicanos metabolicamente marcados, a liberação enzimática das glicoproteínas e análise por HPLC.

Pulso-chase Análise de Cadeias N-linked Açúcar de Glicoproteínas em células de mamíferos

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

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Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

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Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

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EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

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Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

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Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

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Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...