Name: development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00
Duration: 10 min 49 s
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Diese Arbeit wird durch die NICHD / NIH (1R01HD053287) zu Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039), um Vogt und NHLBI / NIH (1R01HL088016) zu Tsang finanziert.

1) Stellen Sie Zebrafisch Paarungen und BCI-Behandlung. <ol><li> Zwei Tage vor der Behandlung, zu identifizieren homozygoten männlichen Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 Zebrafisch und Ort individuell in Paarung Tanks 1. Add-Separator und einer Wildtyp-AB * weiblichen Fische und lassen Sie bei der Paarung Käfigen übernachten. </li><li> Am nächsten Morgen nehmen Sie die Trennzeichen und sammeln Embryonen nach 1 Stunde. -Embryonen zu 100mm Gerichte mit E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), Lösung, Inkubation bei 28 ° C für 6 Stunden. Entfernen Sie leere und unbefruchtete Embryonen, fügen frische E3-Lösung und Inkubation über Nacht. </li><li> Sortieren transgenen Embryonen für ähnliche Stufe (24hpf) und einheitliche GFP-Expression. Array Embryonen einzeln in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges E3-Lösung mit der Pipette. Add 200 ul der E3-Lösung mit einem Multi-Kanal-Pipette in jede Vertiefung. </li><li> Fügen Sie die folgenden Verbindungen als aufgelistet: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr ><td> A </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> B </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> C </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1mm) </td><td> 2μl BCl (2mm) </td><td> 2μl BCl (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> Endkonzentrationen sind 1 &amp;mgr;, 5 um, 10 um, 20 um, 25 um BCI in 1% DMSO. Abdeckplatte in Alufolie und inkubieren für 6 Stunden bei 28 ° C. </li></ol> 2) Automated Imaging von 96-Well-Platten und-analyse. <ol><li> Add 10 &amp;mgr; l der Tricaine (0,61 mm) in jede Vertiefung zu 30hpf Embryonen zu betäuben. </li><li> Lastplatte in Molecular Devices ImageXpress Ultra. </li><li> Öffnen Metaxpress Software. Wählen Sie eine Konfiguration mit 4-fach Objektiv und maximale Durchmesser der Blende, konfigurieren Laserautofokus auf Plattenboden erkennen und bestimmen optimale Z-Ebene in Regionen von Interesse zu erkennen. Erwerben Sie Bilder auf Anregung / Emissionswellenlängen 488/525 nm (GFP). Set Scan-Bereich als eine einzige Stelle 2000x2000 Pixel (4 x 4 mm) ohne Binning. Konfigurieren Laserleistung und gewinnen, so dass hellsten Regionen in positive Kontrolle Abbildungen müssen nicht sättigen. Überprüfen Sie die Bildaufnahme in mehreren positiven und negativen Kontroll-Wells. </li><li> Starten Platte zu scannen. Das Gerät wird automatisch erwerben Bildern aus allen Vertiefungen und archivieren sie in einer SQL Server-Datenbank. </li><li> Bilder hochladen in Definiens Developer mit dem Cellenger application module und ein Import-Filter, der Bild-Format und Datei-Struktur, die durch die Molecular Devices ImageXpress Ultra-Plattform generiert erkennt. </li><li> Prozess Bilder mit einer speziell entworfenen Cognition Network Technology Algorithmus (auch als einen Regelsatz). Der Algorithmus, den wir Sitte auf einer kürzlich veröffentlichten Regelsatz 2-Basis entwickelt wurde, ist entworfen, um automatisch zu identifizieren Embryo, Eigelb, und Kopf, und die Helligkeit und den Bereich der GFP-exprimierenden Kopf Strukturen zu quantifizieren. Wells, in denen kein Embryo nachgewiesen ist oder wo der Kopf kann nicht eindeutig zugeordnet werden (z. B. mit hoher Verbindung Toxizität oder unscharfe Bilder) werden aus der Analyse ausgeschlossen. Konfigurieren Sie den Algorithmus mit mehreren negativen Kontrolle Bilder (Fahrzeug behandelt) und der positiven Kontrolle Bilder (BCI) behandelt, so dass Kopf und Eigelb richtig in beide identifiziert. Setzen Sie ein &quot;Kopf-Strukturen&quot; Nachweisgrenze als Vielfaches der mittleren Eigelb Intensität bis zur Erkennung von hellen Kopf Strukturen entspricht die visuelle Beobachtung. Definieren Sie Parameter für den Export. In diesem Beispiel wurde die informative Parameter die gesamte integrierte Helligkeit des GFP-positive Regionen innerhalb des Kopfes, nachfolgend als &quot;totalen Kopf Strukturen Helligkeit&quot; (Abbildung 1). <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 Graph depicitng die dosisabhängige Wirkung von BCI auf GFP-Expression in transgenen Embryos. </li><li> Führen Sie den Algorithmus, der auf allen Platten Bilder mit der integrierten Job-Scheduler. Die Definiens-Software verwendet verteiltes Rechnen auf mehreren Prozessoren (&quot;Engines&quot;), wodurch die gleichzeitige Analyse mehrerer Bilder. Der Algorithmus berechnet numerische Maßnahmen auf die Ergebnisse der Bildanalyse, die in der Datenbank gespeichert sind zusammen mit einer Kopie des zu bearbeitenden Bildes mit der Analyse angewendet wird. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Nachdem alle Bilder analysiert werden, können die Daten innerhalb Cellenger visualisiert oder exportiert Software von Drittanbietern (Excel, GraphPad Prism) zur weiteren Analyse und grafische Darstellung. Abbildung 2 zeigt archivierte Bilder scannen aus einem Fahrzeug behandelt und gut, mit und ohne CNT-Analyse angewendet BCI-behandelt. Abbildung 1 Dokumente eine dosisabhängige Wirkung von BCI auf GFP Expression des Reportergens in Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 Embryonen. Die Konzentration erforderlich, um eine halbmaximale Reaktion (EC50) zu entlocken war etwa 12 um. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 Automatisierte Bilderfassung und Analyse von transgenen Zebrafisch-Embryos. Pt6 Embryo 30hpf: (A) DMSO Fahrzeug Tg (d2EGFP dusp6) behandelt. (B) Transgene Embryonen mit 20 um BCI zeigen behandelt steigt in die GFP-Expression. (C) Bild von Embryos aus (A) nach dem Ausführen Definiens Regelsatz auf GFP-Expression in den Kopf zu finden. Orange Flecken bezeichnen, wo die Software GFP Intensität Maßnahmen. (D) Bild von Embryos aus (B) nach dem Ausführen Definiens Regelsatz auf GFP-Expression in den Kopf zu finden. Orange Flecken bezeichnen, wo die Software GFP Intensität Maßnahmen. Beachten Sie, dass der Regelsatz in der Lage, einen erweiterten Bereich der GFP-Expression in den behandelten Embryo zu finden war.

<ol>
	<li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li><li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li><li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li></ol>

Ein wesentlicher Faktor, der den Durchsatz von Zebrafisch-chemischen Bildschirmen ist der Mangel an Methoden zur systematischen Prozess 96-Well-Platten für die Bildgebung und Analyse. Weil Bilder von vielzelligen Organismen komplexer, geringem Kontrast sind und heterogener Natur, nicht vorhandenes Bild-Analyse-Algorithmen zur Detektion und Quantifizierung spezifischer Strukturen innerhalb des Organismus. Die meisten veröffentlichten Zebrafisch chemische Bildschirme sind daher mit visuellen Prüfung der einzelnen Vertiefungen durch engagierte Mitarbeiter während des gesamten Verfahrens. Normalerweise verhindert die Erzeugung von numerischen Anzeigen und eine vollständige Archivierung der Bildschirm Bilder und Daten. Darüber hinaus entfällt die manuelle Auswertung einige wesentliche Vorteile von image-based Screening, das heißt die Fähigkeit, retrospektive Analysen von Screen-Performance durchzuführen, um phänotypische Veränderungen, die nicht der primäre Fokus des Screening-Kampagne (zB Toxizität oder Entwicklungsstörungen) zu untersuchen und Kreuz -Referenz-Screening-Daten mit Vergangenheit oder Zukunft Bildschirme mit der gleichen Verbindung Bibliothek. In diesem Bericht haben wir Highlight Methodik zur automatisierten Abbildung und Analyse von Zebrafisch-Embryonen in Mikrotiterplatten ohne Eingreifen des Benutzers. Wir automatisierte Bildaufnahme auf einem ImageXpress Ultra-Laser-Scanning-konfokale (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), um Bild Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 Embryonen in 96-Well-Platten und entwickelte eine Bildanalyse-Algorithmus auf Definiens Cognition Network Technology, die quantifiziert GFP basiert Ausdruck in den Köpfen der transgenen Embryos. Die Methode geliefert abgestuften Antworten und quantifiziert die in-vivo-Aktivität eines kleinen Moleküls Aktivator von FGF-Signalisierung. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der Epifluoreszenz-basierte ArrayScan II (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) erhalten zu dokumentieren, dass es möglich ist, automatisierte Bildaufnahme von Zebrafisch-Embryonen auf eine Vielzahl von kommerziell erhältlichen Platereader 2 getroffen haben. Die Entwicklung von Methoden zur automatischen Analyse vielzelligen Organismus Bildern eliminiert die Notwendigkeit für die visuelle Scoring durch einen menschlichen Beobachter und aktiviert die Generierung und Archivierung von numerischen Daten und Bilder für retrospektive Analysen und Vergleiche mit Zukunft Bildschirme.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (MS222)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Cat.# A-5040</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Wir demonstrieren die Anwendung der Image-basierten High-Content-Screening (HCS)-Methode, um kleine Moleküle, die Modulation der FGF / RAS / MAPK-Weg kann in Zebrafisch-Embryonen zu identifizieren. Der Zebrafisch Embryo ist ein ideales System für In-vivo-High-Content-chemischen Bildschirme. Die 1-Tage alten Embryo ist ca. 1mm im Durchmesser und lässt sich einfach in 96-Well-Platten, ein Standardformat für das Hochdurchsatz-Screening angeordnet werden. Während der ersten Tage der Entwicklung, sind Embryonen transparent mit den meisten der wichtigsten Organe vorhanden, so dass Visualisierung von Gewebe-Bildung während der Embryogenese. Die vollständige Automatisierung der Zebrafisch-chemischen Bildschirmen ist immer noch eine Herausforderung, aber vor allem in der Entwicklung von automatisierten Bildaufnahme und-analyse. Wir zuvor generierte eine transgene Reporter Linie, grün fluoreszierende Protein (GFP) bringt unter der Kontrolle von FGF-Aktivität und demonstriert deren Nutzen in der chemischen-Bildschirme<sup&gt; 1</sup&gt;. Um festzustellen, Methodik für hohen Durchsatz gesamten Organismus Bildschirme, entwickelten wir ein System für die automatisierte Abbildung und Analyse von Zebrafisch-Embryonen bei 24-48 Stunden nach der Befruchtung (HPF) in 96-Well-Platten<sup&gt; 2</sup&gt;. In diesem Video stellen wir die Verfahren für Anordnen transgenen Embryonen in Mikrotiterplatten bei 24hpf und die Zugabe eines kleinen Moleküls (BCI), dass FGF-Signale hyperactivates<sup&gt; 3</sup&gt;. Die Platten werden für 6 Stunden durch die Zugabe von Tricaine Larven vor Automated Imaging auf einem Molecular Devices ImageXpress Ultra-Laser-Scanning-konfokale HCS Leser betäuben gefolgt inkubiert. Die Bilder werden von Definiens Developer-Software mit einer Cognition Network Technology Algorithmus, die wir entwickelt, um nachzuweisen und zu quantifizieren Expression von GFP in den Köpfen der transgenen Embryos verarbeitet. In diesem Beispiel heben wir die Fähigkeit des Algorithmus, um eine dosisabhängige Wirkung von BCI auf GFP Reportergen-Expression in den behandelten Embryonen zu messen.

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Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Wir berichten über die Entwicklung eines Systems zur automatisierten Abbildung und Analyse von Zebrafisch-transgenen Embryos in Mikrotiterplatten. Dies demonstriert die Fähigkeit, dosisabhängige Wirkung eines kleinen Moleküls, BCI, auf Fibroblast Growth Factor Expression des Reportergens zu messen und Technologie für den Aufbau High-Throughput-Zebrafisch chemische Bildschirme.

Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automatische optische Heartbeat-Analyse von kleinen Herzen

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Ein schnelles automatisiertes Protokoll zur Muskelfaser Populationsanalyse in Rattenmuskelquerschnitte Mit Myosin Heavy Chain Immunhistochemie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...