Name: development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי NICHD / NIH (1R01HD053287) כדי Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) כדי ווגט, NHLBI ו / NIH (1R01HL088016) כדי צאנג.

1) הגדרת הזדווגויות דג הזברה וטיפול BCI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני הטיפול, לזהות Tg זכר הומוזיגוטים (dusp6: d2eGFP) pt6 דג הזברה מקום בנפרד לתוך טנקים ההזדווגות 1. הוסף מפריד וסוג בר דגים AB * הנקבה ולהשאיר בכלובים ההזדווגות בין לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר להסיר מפריד, ולאסוף עוברים אחרי שעה 1. העברת עוברים למנות 100mm עם E3 (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4), פתרון לדגור על 28 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות. הסר מתים מופרית עוברים, להוסיף פתרון E3 טריים, דגירה בין לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין מהונדס עוברים לשלב דומה (24hpf) והביטוי GFP אחידה. מערך עוברים בנפרד לתוך הבאר כל צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון E3 עם עודף micropipette. הוסף 200μl של פתרון E3 עם pipettor רב ערוצי לתוך היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את התרכובות הבאות כמפורט: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr ><td> </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> ב </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> ג </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mז) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl Bcl (0.1mm) </td><td> 2μl Bcl (0.5mm) </td><td> 2μl Bcl (1mm) </td><td> 2μl Bcl (2 מ&quot;מ) </td><td> 2μl Bcl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> ריכוזים הסופי הם 1μM, 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI ב DMSO 1%. מכסים בנייר אלומיניום צלחת ו דגירה במשך 6 שעות 28 ° C. </li></ol> 2) אוטומטי הדמיה של 96-היטב צלחות ניתוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10μl של tricaine (0.61mM) זה גם להרדים עוברים 30hpf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען לתוך צלחת מולקולרית התקנים Imagexpress Ultra. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תוכנה Metaxpress. בחר תצורה עם מטרה 4x ואת קוטר חריר מקסימלית, להגדיר לייזר פוקוס אוטומטי לזהות תחתית צלחת, ולקבוע אופטימלי Z-המטוס כדי לזהות אזורים של עניין. לרכוש תמונות על עירור / פליטה באורכי גל של 488/525 ננומטר (GFP). הגדר לסרוק שטח כאתר יחיד של 2000x2000 פיקסלים (4 x 4 מ&quot;מ) עם binning לא. הגדרת כוח לייזר ולהשיג כזו האזורים הבהירים בתמונות בקרה חיובית לא מרווה. אישור הרכישה תמונה נכונה בכמה בארות בקרה חיוביים ושליליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל סריקה צלחת. המכשיר באופן אוטומטי לרכוש תמונות מכל הבארות וארכיון אותם נתונים של SQL Server. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלאת תמונות לתוך מפתחים Definiens באמצעות מודול יישום Cellenger ואת מסנן ייבוא ​​שמכירה פורמט התמונה מבנה קובץ שנוצר על ידי פלטפורמת התקנים מולקולריים Ultra Imagexpress. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך תמונות עם אלגוריתם אישית מעוצבת Network Technology קוגניציה (שמכונה גם ruleset). האלגוריתם, אשר אנו מותאם אישית שפותחה על בסיס ruleset שפורסם לאחרונה 2, נועד לזהות באופן אוטומטי העובר, חלמון, והראש, לכמת את הבהירות לאזור ה-GFP-לבטא מבנים הראש. וולס שבו אין העובר מזוהה או שבו ראש לא ניתן להקצות באופן חד משמעי (למשל, עם רעילות גבוהה או מחוץ למתחם של תמונות מוקד) אינם נכללים בניתוח. הגדר את האלגוריתם באמצעות כמה תמונות בקרה שלילית (הרכב מטופל) ותמונות בקרה חיובית (BCI מטופלים) כזה ראש חלמון מזוהים כהלכה בשני. הגדר &quot;מבנים ראש&quot; זיהוי סף כמו בכפולות של עוצמת חלמון אומר עד לגילוי של מבנים ראש בהיר תואם תצפית ויזואלית. הגדרת פרמטרים לייצא. בדוגמה זו, פרמטר אינפורמטיבי ביותר היה בהירות משולב הכולל של ה-GFP חיובי אזורים בתוך הראש, המכונה להלן &quot;ראש הכולל מבנים בהירות&quot; (איור 1). <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="דמות 1" /> איור 1 גרף depicitng ההשפעות תלויות במינון של BCI על ביטוי של GFP בעוברים מהונדס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את האלגוריתם על כל התמונות צלחת באמצעות מתזמן עבודה משולבת. התוכנה משתמשת Definiens מחשוב מבוזר על כמה מעבדים (&quot;מנועי&quot;), דבר המאפשר ניתוח סימולטני של מספר רב של תמונות. האלגוריתם מחשב את צעדי מספריים על סמך תוצאות מתוך ניתוח התמונה, אשר נשמרים במסד הנתונים יחד עם עותק של התמונה מעובד, עם ניתוח מיושם. </li></ol> נציג תוצאות: אחרי כל התמונות מנותחות, נתונים ניתן דמיינו בתוך Cellenger או מיוצא תוכנות צד שלישי (Excel, GraphPad פריזמה) עבור ניתוח נוסף ייצוג גרפי. איור 2 מראה בארכיון לסרוק תמונות מרכב מטופלים BCI-יחס טוב, עם או בלי ניתוח CNT מיושם. איור 1 מסמכים השפעה תלוית מינון של BCI על ביטוי גנים GFP כתב Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 עוברים. הריכוז הדרוש לתגובה מקסימלית וחצי (EC50) היה כ 12 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="דמות 2" /> איור 2 תמונה ללכוד ניתוח אוטומטי של העוברים דג הזברה מהונדס. (א) הרכב מטופל DMSO Tg (dusp6: d2eGFP) pt6 העובר על 30hpf. (ב) עוברים טראנסגנטי שטופלו להראות BCI 20μM עליות ביטוי של GFP. (ג) תמונה של העובר מן (א) לאחר הפעלת Definiens ruleset למצוא ביטוי של GFP בראש. כתמים כתומים מציינים שם תוכנה האמצעים עוצמת ה-GFP. (ד) העובר מקדימה של מ (ב &#39;) לאחר שרץ Definiens ruleset למצוא ביטוי של GFP בראש. כתמים כתומים מציינים שם תוכנה האמצעים עוצמת ה-GFP. שים לב ruleset הצליח למצוא באזור המורחב של ה-GFP ביטוי בעובר טיפול.

<ol>
	<li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li><li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li><li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li></ol>

הגורם העיקרי המגביל את התפוקה של מסכי דג הזברה כימיים היא חוסר מתודולוגיה לתהליך שיטתי 96-גם צלחות עבור הדמיה וניתוח. בגלל תמונות של אורגניזמים תאיים הם בניגוד מורכבים, נמוך, הטרוגנית בטבע, קיים ניתוח אלגוריתמים התמונה מצליחים לזהות ולכמת מבנים ספציפיים בתוך האורגניזם. רוב שפורסם כימיים מסכי דג הזברה ולכן כרוך בדיקה ויזואלית של בארות הפרט על ידי אנשי מוקדש בכל ההליך. בדרך כלל זה מונע את הדור של readouts מספרית מוחלטת בארכיון של תמונות מסך ונתונים. יתר על כן, הערכה ידנית מבטלת יתרונות מרכזיים של ההקרנה מבוססות תמונה, כלומר את היכולת לנהל ניתוח רטרוספקטיבי של ביצועי המסך, כדי לבחון שינויים פנוטיפי שלא היו המוקד העיקרי של הקמפיין ההקרנה (למשל, רעילות או ליקויים התפתחותיים) ו לחצות הפניה ההקרנה נתונים עם מסכי בעבר או בעתיד באמצעות ספריה המתחם זהה. בדו&quot;ח זה אנו מדגישים מתודולוגיה הדמיה ניתוח אוטומטי של עוברי דג הזברה בצלחות multiwell ללא התערבות המשתמש. אנחנו ללכוד תמונה אוטומטית על לייזר ImageXpress Ultra סריקה confocal הקורא (התקנים מולקולריים, Sunnyvale, CA) לתמונה Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 עוברים 96 צלחות היטב פיתחה אלגוריתם עיבוד תמונה מבוסס על טכנולוגיה &quot;Definiens רשת קוגניציה כי GFP לכמת ביטוי את ראשיהם של עוברי מהונדס. השיטה מועברת התגובות מדורגים לכמת בפעילות vivo של מולקולה קטנה activator של FGF איתות. תוצאות דומות התקבלו עם epifluorescence מבוססי ArrayScan II (Cellomics Inc, פיטסבורג רש&quot;פ) המתעדים כי ניתן ליישם לכידת תמונה אוטומטי של עוברי דג הזברה על מגוון רחב של קוראי צלחת זמינים מסחרית 2. פיתוח המתודולוגיה באופן אוטומטי לנתח תמונות אורגניזם רב לבטל את הצורך הבקיע חזותי על ידי הצופה האדם ואפשרה את הדור בארכיון של נתונים מספריים תמונות לניתוח רטרוספקטיבי השוואות עם מסכי בעתיד.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (MS222)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Cat.# A-5040</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

אנו להדגים את היישום של התמונה מבוססי מתודולוגיה גבוהה תוכן ההקרנה (HCS) כדי לזהות מולקולות קטנות שיכולות לווסת את מסלול FGF / RAS / MAPK עוברי דג הזברה. העובר דג הזברה הוא אידיאלי עבור מערכת ב-high-vivo תוכן מסכי כימיים. עובר יום 1 הישן הוא כ 1 מ&quot;מ בקוטר יכול להיות ערוכים בקלות לתוך צלחות 96, טוב, פורמט סטנדרטי עבור הקרנת תפוקה גבוהה. במהלך היום הראשון של הפיתוח, עוברים הם שקופים עם רוב האיברים העיקריים הנוכחי, ובכך לאפשר הדמיה של היווצרות רקמות במהלך embryogenesis. אוטומציה מלאה של מסכי דג הזברה כימי הוא עדיין אתגר, לעומת זאת, במיוחד בפיתוח של רכישת התמונה ניתוח אוטומטי. אנחנו קודם שנוצר קו כתב מהונדס המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה של ​​פעילות FGF והפגינו השירות שלהם מסכי כימיים<sup&gt; 1</sup&gt;. כדי ליצור מתודולוגיה גבוהה מסכי התפוקה כל אורגניזם, פיתחנו מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של עוברי דג הזברה ב 24-48 שעות שלאחר ההפריה (hpf) ב 96-גם צלחות<sup&gt; 2</sup&gt;. בסרט זה אנו מדגישים את הליכי עריכה עוברים מהונדס לתוך צלחות multiwell ב 24hpf ועל תוספת של מולקולה קטנה (BCI) כי hyperactivates FGF איתות<sup&gt; 3</sup&gt;. הצלחות מודגרת במשך 6 שעות לאחר מכן על ידי תוספת של tricaine להרדים הזחלים לפני הדמיה אוטומטית על התקנים מולקולריים ImageXpress Ultra סריקת לייזר confocal HCS הקורא. תמונות מעובדים על ידי תוכנה המפתחים Definiens באמצעות רשת קוגניציה וטכנולוגיה האלגוריתם שפיתחנו כדי לזהות ולכמת ביטוי של GFP על ראשיהם של עוברי מהונדס. בדוגמה זו אנו מדגישים את היכולת של האלגוריתם כדי למדוד מינון תלויי השפעות BCI על הביטוי העיתונאי GFP גנים העוברים טיפול.

Watch this Scientific Journal Video about Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. at JoVE.com

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

אנו מדווחים על פיתוח של מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של העוברים מהונדס דג הזברה בצלחות multiwell. זה מדגים את היכולת לאמוד את ההשפעות תלויות במינון של מולקולה קטנה, BCI, על גדילה פיברובלסטים ביטוי פקטור כתב גנים לספק טכנולוגיה להקמת תפוקה גבוהה כימיים מסכי דג הזברה.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

חצי אוטומטיות Heartbeat ניתוח אופטי של לבבות קטנים

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...