Name: development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. at JoVE.com

Detta arbete finansieras av NICHD / NIH (1R01HD053287) till Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) till Vogt och NHLBI / NIH (1R01HL088016) till Tsang.

1) Ställ in zebrafisk parningar och BCI behandling. <ol><li> Två dagar före behandlingen, identifiera homozygot manliga Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 zebrafisk och placera sig i parning tankar 1. Lägg till separatorn och en vild typ AB * honor och lämna i parning burar över natten. </li><li> Nästa morgon tar bort separatorn, och samla in embryon efter 1 timme. Överför embryon till 100mm rätter med E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), lösning och inkubera vid 28 ° C i 6 timmar. Ta bort döda och obefruktade embryon, tillsätt färska E3-lösning, och inkubera över natten. </li><li> Sortera transgena embryon för ett liknande (24hpf) och enhetlig GFP uttryck. Array embryon individuellt i varje brunn på en 96-brunnar. </li><li> Ta bort överflödig E3-lösning med en mikropipett. Tillsätt 200μl av E3-lösning med en flerkanals pipett i varje brunn. </li><li> Lägg till följande föreningar som anges: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr ><td> En </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> B </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> C </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr ><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0,5 mm) </td><td> 2μl BCL (1 mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> Slutlig koncentrationer 1μM, 5μM, 10μM, 20 mikroM, 25μM BCI i 1% DMSO. Täckplåt i aluminiumfolie och inkubera i 6 timmar vid 28 ° C. </li></ol> 2) Automatisk avbildning av plattor med 96 brunnar och analys. <ol><li> Tillsätt 10μl av tricaine (0.61mM) i varje brunn att söva 30hpf embryon. </li><li> Lastskylt in Molecular Devices Imagexpress Ultra. </li><li> Öppna Metaxpress programvara. Välj en konfiguration med en 4x objektiv och största hål diameter, konfigurera laser autofokus för att upptäcka platta botten, och bestämma optimala Z-plan för att upptäcka områden av intresse. Hämta bilder på excitation / emission våglängder av 488/525 nm (GFP). Ställ skanningsområde som en enda plats 2000x2000 pixlar (4 x 4 mm) utan binning. Konfigurera laser makt och vinna så att ljusaste regioner i positiv kontroll bilderna inte mättad. Bekräfta korrekt bild förvärv i flera positiva och negativa kontrollbrunnarna. </li><li> Starta tallrik skanna. Instrumentet kommer automatiskt att få bilder från alla brunnar och arkivera dem i en SQL Server-databas. </li><li> Ladda upp bilder till Definiens Developer använder Cellenger ansökan modulen och en import filter som känner igen bildformatet och filstrukturen skapas av Molecular Devices Imagexpress Ultra plattform. </li><li> Bearbeta bilder med en färdig konstruerad Cognition Network Technology algoritm (även kallad en regeluppsättning). Algoritmen, som vi anpassade utvecklats utifrån en nyligen publicerad regeluppsättning 2, är utformad för att automatiskt identifiera embryo, äggula och huvud, och att kvantifiera ljusstyrka och området GFP-uttryckande huvudet strukturer. Brunnar där ingen embryot upptäcks eller när huvudet inte entydigt kan tilldelas (till exempel med hög förening toxicitet eller oskarpa bilder) ingår inte i analysen. Konfigurera den algoritm som med hjälp av flera negativ kontroll bilder (fordon som behandlas) och positiva bilder kontroll (BCI behandlade) så att huvudet och äggula korrekt identifiering i båda. Ställ in ett &quot;huvud strukturer&quot; detektionsgränsen som multipler av menar äggula intensitet tills detektering av ljusa huvud strukturer matcher visuell observation. Definiera parametrar för att exportera. I detta exempel var den mest informativa parametern hela den integrerade ljusstyrka GFP-positiva regioner i huvudet, nedan kallad &quot;total huvudet strukturer ljusstyrka&quot; (figur 1). <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1 Diagram depicitng den dosberoende effekter BCI på GFP uttryck i transgena embryon. </li><li> Kör algoritmen på alla platta bilder med den inbyggda jobbet schemaläggaren. Den Definiens Programvaran använder distribuerad databehandling på flera processorer (&quot;motorer&quot;), vilket möjliggör samtidig analys av flera bilder. Algoritmen beräknar numeriska åtgärder baserade på resultaten från de bildanalys, som sparas i databasen tillsammans med en kopia av den bearbetade bilden, tillämpas med analys. </li></ol> Representativa resultat: Efter alla bilder analyseras, kan data visualiseras i Cellenger eller exporteras till tredje parts programvara (Excel, GraphPad Prism) för vidare analys och grafisk presentation. Figur 2 visar arkiverade skanna bilder från ett behandlat fordon och en BCI-behandlas väl, med och utan CNT analys tillämpats. Figur 1 dokument en dosberoende effekt av BCI på GFP reporter genuttryck i Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embryon. Den koncentration som krävs för att framkalla en halv maximal respons (EC50) var cirka 12 mikroM. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2 Automatiserad Bildinsamling och analys av transgena zebrafisk embryon. (A) DMSO fordon behandlas Tg (dusp6: d2eGFP) PT6 embryo 30hpf. (B) Transgena embryon som behandlats med 20 mikroM BCI visar ökningar av GFP uttryck. (C) Bild av embryon från (A) efter att ha kört Definiens regeluppsättning för att hitta GFP uttryck i huvudet. Orange fläckar beteckna där programvaran åtgärder GFP intensitet. (D) Bild av embryon från (B) efter att ha kört Definiens regeluppsättning för att hitta GFP uttryck i huvudet. Orange fläckar beteckna där programvaran åtgärder GFP intensitet. Observera att regeluppsättning kunde hitta ett utökat område av GFP uttryck i det behandlade embryot.

<ol>
	<li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li><li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li><li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li></ol>

En viktig faktor som begränsar genomströmningen av zebrafisk kemiska skärmar är bristen på metoder för att systematiskt bearbeta 96-brunnar för avbildning och analys. Eftersom bilder av flercelliga organismer är komplexa, låg kontrast och heterogena i naturen, befintliga bildanalys algoritmer misslyckas med att upptäcka och kvantifiera specifika strukturer inom organismen. De flesta publicerade zebrafisk kemiska skärmar innebär därför visuell undersökning av enskilda brunnar av hängivna personal under hela förfarandet. Detta förhindrar vanligtvis generationen av numeriska avläsning och en komplett arkivering av skärmbilder och data. Dessutom eliminerar manuell utvärdering flera viktiga fördelar av bild-screening, det vill säga förmågan att leda retrospektiva analyser av skärmens prestanda, för att undersöka fenotypiska förändringar som inte var det primära målet för screening kampanjen (t.ex. toxicitet eller utveckling fel) och att korsa referens screening data med tidigare eller framtida skärmar med samma förening bibliotek. I denna rapport lyfter vi fram metodik för automatiserad bildbehandling och analys av zebrafisk embryon multispot plattor utan att användaren behöver. Vi automatiserade Bildinsamling på en ImageXpress Ultra laserskanning konfokala läsare (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) för att bilden Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embryon i 96 brunnar och utvecklat en algoritm bild analys baserad på Definiens &quot;Cognition nätverksteknik som kvantifieras GFP uttryck i huvudet av transgena embryon. Metoden levereras graderade svar och kvantifieras in vivo aktivitet hos en liten molekyl aktivator av FGF signalering. Liknande resultat erhölls med epifluorescence-baserade ArrayScan II (Cellomics Inc, Pittsburgh PA) dokumentera att det är möjligt att genomföra automatiserade ta bilder zebrafisk embryon på olika kommersiellt tillgängliga plattan läsare 2. Utvecklingen av metoder för att automatiskt analysera flercellig organism bilder eliminerat behovet av visuella poängsättning av den mänskliga observatören och gjorde det möjligt för generering och arkivering av numeriska data och bilder för retrospektiv analys och jämförelser med framtida skärmar.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (MS222)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Cat.# A-5040</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Vi visar tillämpningen av bildbaserade hög halt screening (HCS) metod för att identifiera små molekyler som kan modulera FGF / RAS / MAPK väg i zebrafisk embryon. Den zebrafisk embryot är ett idealiskt system för in vivo hög halt kemiska skärmar. Den 1-dags gammal embryot är ca 1 mm i diameter och kan enkelt klädd i 96-hålsplattor, ett standardformat för hög throughput screening. Under den första dagen av utveckling, embryon är transparenta med de flesta av de stora organen närvarande, vilket möjliggör visualisering av vävnad bildas under fosterutvecklingen. Den kompletta automatisering av zebrafisk kemiska skärmar är fortfarande en utmaning, men framför allt i utvecklingen av automatiserade bild insamling och analys. Vi genererade tidigare en transgen reporter linje som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av FGF aktivitet och visat sin nytta i kemiska skärmar<sup&gt; 1</sup&gt;. Att etablera metodik för hög genomströmning hela organismen skärmar har vi utvecklat ett system för automatiserad bildbehandling och analys av zebrafisk embryon till 24-48 timmar efter befruktning (HPF) i 96-brunnars plattor<sup&gt; 2</sup&gt;. I denna video vi lyfta fram rutiner för arraying transgena embryon i multispot plattorna vid 24hpf och tillägget av en liten molekyl (BCI) som hyperactivates FGF signalering<sup&gt; 3</sup&gt;. Plattorna inkuberas i 6 timmar, följt av tillsats av tricaine att söva larver innan automatiserad bildbehandling på molekylär enheter ImageXpress Ultra laserskanning konfokala HCS läsare. Bilderna bearbetas av Definiens Utvecklare programvara med en Kognition algoritm nätverksteknik som vi utvecklat för att upptäcka och kvantifiera uttryck av GFP i huvudet av transgena embryon. I detta exempel har vi lyfta fram möjligheten för algoritm för att mäta dosberoende effekter BCI på GFP reporter genuttryck i behandlade embryon.

Watch this Scientific Journal Video about Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. at JoVE.com

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Vi rapporterar utvecklingen av ett system för automatiserad bildbehandling och analys av zebrafisk transgena embryon i multispot plattor. Detta visar på möjligheten att mäta dosberoende effekter av en liten molekyl, BCI, på Fibroblast Growth Factor reporter genuttryck och erbjuda teknik för att fastställa hög genomströmning skärmar zebrafisk kemikalie.

Utveckling av automatiserad bildbehandling och analys för zebrafisk kemiska skärmar.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semi-automatisk optisk Heartbeat Analys av små hjärtan

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantation av GFP-uttryckande blastomerer för Live avbildning av näthinnan och hjärnans utveckling hos chimära Zebrafish embryon

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans i Zebrafish embryon genom Metabola märkning och Bioorthogonal Klicka Kemi

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

Kvantitativa och automatisk hög genomströmning Genomvid RNAi skärmar i C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Cell Spårning Med Photoconvertible proteiner under Zebrafish Utveckling

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Semi-automatisk avbildning av vävnad-specifika fluorescens i Zebrafish embryon

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source Hög innehållsanalys Använda automatiserade fluorescens Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

En Rapid Automatiserad Protokoll för Muscle Fiber Population Analysis i råttmuskel Cross sektioner med hjälp tunga kedjan från myosin Immunohistokemi

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...