Name: sds-page/immunoblot detection of a&beta; multimers in human cortical tissue homogenates using antigen-epitope retrieval
Uploaded: 2010-04-23T04:53:00
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일레인 Pranski 우수한 기술 지원 캐롤린 Suwyn와 해리 레빈 III, M. 폴 머피, 중요한 대화를 게어링 말라 많은 감사드립니다. 기금은 RR - 00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, 우드러프 재단과 에모리 대학 조사위원회에 의해 제공되었다.

1 부 : 명확히 조직 homogenates의 작성 <ol><li> 약 30도 유봉 스트로크로 (즉, 추가 400μl 버퍼 - 얼음처럼 차가운 버퍼 (플러스 2X 프로 테아제 억제제 칵테일 [산타크루즈] 0.1M 인산 버퍼 호수 [와 MG + + 무료 칼슘 + +])의 4 번 볼륨에서 수정되지 않은 대뇌 피질의 조직을 균질 다운스 100mg 조직). </li><li> 3000 5 분 스핀 homogenates g (4 ° C). 조심스럽게 -80에서 명확히 supernatants 이들 추출물의 저장 aliquots를 제거 ...

<ol>
	<li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer's+disease:+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics.">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li><li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration:+lessons+from+the+Alzheimer's+amyloid+beta-peptide.">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li><li>Walker, L. C., LeVine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebral+proteopathies.">The cerebral proteopathies.</a> Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+amyloid,+and+Alzheimer's+disease:+a+perspective+in+honor.">Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor.</a> of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).</li><li>Walsh, D. M., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+oligomers+-+a+decade+of+discovery.">Abeta oligomers - a decade of discovery.</a> J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).</li><li>Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+immunoblot+sensitivity+by+heating+of+hydrated+filters.">Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters.</a> Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).</li><li>Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schr&#246;der, J., Zerfass, R., F&#246;rstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+hetergeneous+A4+peptides+in+human+cerebrospinal+fuid+and+blood+by+a+newly+developed+sensitive+Western+blot+assay.">Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay.</a> J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).</li></ol>

알츠하이머 병 1,4,5의 pathogenesis에서 Aβ 집합의 중요성에도 불구하고, 몇 가지 연구가 설명 또는 인간의 대뇌 피질의 조직 샘플 2 다양한 Aβ multimers의 분포를 계량 있습니다. 일반적으로 사용되는 immunohistochemical 기법은 고정 피질 조직에서 서로 다른 multimeric Aβ 종의 차별에 대한 허용하지 않습니다. 떼어낸 피질 조직 homogenates에서 Aβ multimers는 분리와 화학적 겔 전기 영동과 항체 ?...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>Sc-29130</td>
<td>1 tablet in 25ml buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>BCA Protein Assay kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoFisher Scientific</td>
<td>23225</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC1676</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>NP0004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC5925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC6625BOX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrocellulose membranes, 0.2 &mu;m pore size</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC1675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC3675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SimplyBlue SafeStain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6060</td>
<td>Will not interfere with immunostaining</td>
</tr>
<tr>
<td>ATX Ponceau S Red staining solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>09276</td>
<td>Will not interfere with immunostaining</td>
</tr>
<tr>
<td>Kapak heat sealable plastic sample pouches</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0181225AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6E10 mouse monoclonal antibody to A&beta;(1-16)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Covance</td>
<td>SIG-39320</td>
<td>Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB</td>
</tr>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>P2287</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole A&beta; (from sheep)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
<td>NA931-1ML</td>
<td>Dilute at 1:10,000</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoFisher</td>
<td>34077</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kodak Biomax MR Film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carestream Health</td>
<td>870 1302</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

sds-page/immunoblot detection of a&beta; multimers in human cortical tissue homogenates using antigen-epitope retrieval

β - 아밀로이드의 변칙 접지와 중합도 (Aβ) 펩타이드는 알츠하이머 질병 pathogenesis에 neurodegenerative 층계를 시작 생각됩니다<sup&gt; 1</sup&gt;. 알츠하이머 질환에서 대뇌 치매 plaques의 코어에서 발견되는 β - 시트 풍부한 아밀로이드 원섬유로 자체 집계하는 경향이 있거나 42 아미노산 펩타이드 - Aβ는 주로 40. 증거를 증가하면 해당 낮은 분자량이 용해 Aβ의 multimers가 원섬유의의 Aβ의 아밀로이드보다 독성이 제안<sup&gt; 2</sup&gt;. 뇌 조직에서 낮은과 높은 분자량 multimeric Aβ 종의 식별 및 부량는 알츠하이머 질병 연구에 필수적인 목적이며, 또한 고용 방법은 다른 proteopathies에 독성 multimers의 식별 및 특성에 적용할 수있는<sup&gt; 3</sup&gt;. 자연스럽게 발생 Aβ multimers는 Aβ 특정 항체와 immunoblotting 다음 SDS - polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 감지하실 수 있습니다. 그러나, multimeric Aβ의 분리 및 검출은 고농도 대뇌 피질 homogenates 작은 기공 크기 nitrocellulose의 점막에서 항원 검색의 사용을 필요로합니다. 여기서 우리는 명확히 인간의 대뇌 피질 homogenates의 준비를 위해 기술, SDS - PAGE에 의해 단백질의 분리, 그리고 항원 에피토프 복구 / Aβ 펩타이드의 N - 터미널 지역에 항체 6E10과 모래 바닥 서양을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용, 우리는 지속적으로 알츠하이머의 병리와 인간에서 Aβ 단량체, dimers, trimers, tetramers 및 대뇌 피질의 조직에서 높은 분자량의 multimers을 감지.

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SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

우리는 명확히 인간 대뇌 피질 homogenates, SDS - PAGE로 단백질 분리, 항원 검색 및 Aβ 펩타이드에 대한 항체와 immunoblotting의 준비를위한 기술을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 지속적으로 알츠하이머의 병리 현상과 인간의 대뇌 피질 조직에서 monomeric 및 multimeric Aβ를 감지합니다.

인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

고도의 연결을 강화 문화의 생성을위한 두피 조직 블록의 Cryopreservation

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

연구

신경과학

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

Coherence between Brain Cortical Function and Neurocognitive Performance during Changed Gravity Conditions

브레인 두피 기능 및 변경 중력 조건 중 Neurocognitive 성능 사이의 일관성

Previous studies of cognitive, mental and/or motor processes during short-, medium- and long-term weightlessness have only been descriptive in nature, and ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Neuroscientific 연구 및 실시간 기능성 두피 매핑을위한 인적 Electrocorticographic (ECoG) 신호를 녹음하기

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

병합 된 포유류 외피가 대뇌 피 질의 모듈의 시각화

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...