Name: direct restart of a replication fork stalled by a head-on rna polymerase
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase at JoVE.com

Siamo particolarmente grati a Seth Darst per fornire proteine ​​RNAP e MFD e vettori di espressione. Siamo anche ringraziare Sergei Borukhov per la fornitura di Greb e Dan Zhang per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institutes of Health (MOD) e da un Marie-Josee e Henry Kravis Fellowship presso l&#39;Università Rockefeller (RTP).

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz e O&#39;Donnell, Science 327, 590-592 (2010)</a> . 1. Assemblaggio di un complesso RNAP fermato allungamento è stato eseguito come segue: 500 nM concentrazione finale di E. RNAP coli σ 70 Egli è stato mescolato con concentrazione del 5 nM finale di un modello di DNA biotinilato 3,6 kb che contiene il T7A1 promotore in 100 ml di tampone A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glicerolo) per 10 minuti a 37 ° C. 100 mM di Apu e 40 mM ognuno di GTP, ATP e CTP sono stati aggiunti per altri 10 minuti a 37 ° C. 2. Immobilizzazione del complesso RNAP fermato allungamento su perline streptavidina è stata effettuata come segue: 200 ml di streptavidina sfere magnetiche patinata (Invitrogen) sono stati aggiunti alla reazione sopra per 10 minuti a temperatura ambiente. 3. Purificazione del complesso immobilizzato RNAP fermato allungamento è stato effettuato come segue: Le perle (da sopra) sono state lavate 5 volte con 0,9 ml di tampone A contenente 0,75 M di NaCl, 200 mg / ml di eparina, e 20 mg / ml ssDNA (Il surnatante è stato rimosso dopo ogni fase di lavaggio, di separazione magnetica.) Successivamente, la perline sono stati lavati 2 volte con 0,9 ml di tampone A. 4. Formazione di una forchetta replica a valle rispetto alla testa-on RNAP è stata eseguita come segue: Le perle (da sopra) sono stati risospesi in 100 ml di New England Biolabs buffer di 4 e 10 unità di Sap I (New England Biolabs) è stato aggiunto per 10 minuti a 37 ° C. Le perle sono stati lavati 3 volte con 0,9 ml di tampone A e poi risospeso in 50 ml di tampone T4 rapida reazione Legatura (New England Biolabs). 2 l di rapida ligasi T4 (New England Biolabs) è stato aggiunto insieme con 6 nM concentrazione finale di pre-ricotto DNA biforcuta (RP10, RP22, RP25) per 10 minuti a temperatura ambiente. Le perle sono stati lavati 3 volte con 0,9 ml di tampone A. 5. Assemblea dei replisoma e inizio della sintesi filone che porta al bivio replica è stata effettuata come segue: 448 pmol di DnaB (come esamero) è stata incubata con la 150 microlitri perle di tampone A (20 glicerolo mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10%) per 30 s in 23 ° C. 4,9 pmol di Pol III * (Pol III HE meno β), 15 pmol di β, 2 mM ATP, e 60 mM ciascuno dei dGTP e dATP sono state aggiunte ad un volume di 200 l ed incubati per altri 5 minuti a 37 ° C. La replica è stata aperta in seguito l&#39;aggiunta di 10 mcg SSB e 24 mM ognuno di dATP e dTTP con [α-32 P] dTTP e [α-32 P] dCTP (attività specifica, 3.000-5.000 cpm / pmol) ad un volume finale di 250 microlitri. Reazioni sono state terminato dopo 10 minuti su l&#39;aggiunta di 12 ml di 500 mM EDTA. 6. Purificazione e concentrazione del radio-prodotti contrassegnati DNA è stata eseguita come segue: Le perle (da sopra) sono stati bolliti dopo la reazione è stata interrotta al fine di rimuovere il DNA dalle perline. Qualsiasi residuo di DNA che rimangono aderenti al perline è stato rimosso trattando le perle con proteinasi K in un volume di 10 ul per 30 minuti a 50 ° C. Le perle sono state poi bollito e il surnatante è stato rimosso dalla separazione magnetica. Il supernatante combinato contenente il DNA è stato purificato utilizzando il kit di pulizia Qiagen PCR. Purificato radio-marcato DNA dei prodotti sono stati poi analizzati in un gel alcalino di agarosio. Replica * in assenza di uno scontro RNAP fermato complesso allungamento è stata eseguita come sopra, però, σ 70 è stato omesso. Rappresentante dei risultati: Collisione del replisoma con una testa-on RNAP risultati di solito in due prodotti di 2,5 kb e 3,6 kb di lunghezza. Da 2,5 kb prodotto rappresenta la lunghezza del DNA dalla forcella al RNAP fermato ei risultati replisoma stallo sulla collisione con il RNAP. Il prodotto 3,6 kb rappresentare tutta la lunghezza del DNA e dei risultati sia da occupazione incompleta del promotore da parte RNAP o parziale replisoma lettura tramite del capo-on RNAP. Un buon risultato o accurata dimostra che circa il 50% full-length del DNA viene prodotto. Tuttavia, in alcuni casi meno occupazione del promotore da RNAP verifica e una più alta percentuale di full-length del DNA si osserva quanto una popolazione maggiore di replisomes non incontrano uno scontro RNAP. Replica in assenza di un RNAP fermato in un solo full-length del DNA (3,6 kb). <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura. 1 Il replisoma è impedita da una testa-on RNAP. (A) di setup sperimentale. A E. coli RNAP complesso allungamento fermato è stato montato su un DNA biotinilato contenente il promotore T7A1 come descritto in precedenza (9). In breve, un complesso allungamento fermato è stato formato da 20 bps a valle del promotore incubando oloenzima RNAP con il DNA biotinilato per 10 minuti seguita dall&#39;aggiunta di Apu, GTP, ATP e CTP per altri 10 min. Perline streptavidina sono stati aggiunti per altri 10 minuti poi le perle sono state lavate cinque volte ciascuna con 0,9 ml di tampone contenente 0.75M NaCl, 200 mg / ml di eparina, e 100 nM a singolo filamento di DNA per rimuovere instabile RNAP-DNA complessi e NTP in eccesso . Il DNA è stato poi digerito con Sapi, lavato, e legato ad una pre-ricotto DNA biforcuta. Le perle sono stati lavati di nuovo prima del montaggio del replisoma. Il promotore si trova a 2,5 kb dalla forcella ed è orientato alla trascrizione diretta verso la forcella. (B) DnaB è stata aggiunta poi la replisoma è stato assemblato e replica è stato avviato sia in presenza (corsia 2) o assenza (corsia 1) di un a testa alta RNAP.

<ol>
	<li>Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+and+resolving+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription.">Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription.</a> DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).</li><li>Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription-induced+deletions+in+plasmid+vectors:+M13+DNA+replication+as+a+source+of+instability.">Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability.</a> Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).</li><li>Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+modulators+and+DNA+repair+activities+resolve+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription.">RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription.</a> Mol Cell. 19, 247-247 (2005).</li><li>McGlynn, P., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+RNA+Polymerase+by+(p)ppGpp+Reveals+a+RecG-Dependent+Mechanism+for+Replication+Fork+Progression.">Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression.</a> Cell. 101, 35-35 (2000).</li><li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro.">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).</li><li>Labib, K., Hodgson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+barriers:+pausing+for+a+break+or+stalling+for+time.">Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time.</a> EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).</li><li>Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+collapse+at+replication+terminator+sequences.">Replication fork collapse at replication terminator sequences.</a> Embo J. 21, 3898-3898 (2002).</li><li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replisome+mechanics:+insights+into+a+twin+DNA+polymerase+machine.">Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine.</a> Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).</li><li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+replisome+uses+mRNA+as+a+primer+after+colliding+with+RNA+polymerase.">The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase.</a> Nature. 456, 762-762 (2008).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-557 (2006).</li><li>Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Cell. 86, 557-557 (1996).</li><li>Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replisome+assembly+reveals+the+basis+for+asymmetric+function+in+leading+and+lagging+strand+replication.">Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication.</a> J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).</li><li>Kaplan, D. L., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+binding+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+to+DNA.+V.+T7+RNA+chain+initiation+by+enzyme-DNA+complexes.">Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes.</a> Mol Cell. 15, 453-453 (2004).</li><li>Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twin+DNA+pumps+of+a+hexameric+helicase+provide+power+to+simultaneously+melt+two+duplexes.">Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes.</a> Cell. 109, 757-757 (2002).</li><li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+Transcription+repair+coupling+factor+(Mfd+protein)+rescues+arrested+complexes+by+promoting+forward+translocation.">coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).</li><li>Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription-coupled+DNA+repair:+two+decades+of+progress+and+surprises.">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Science. 266, 1957-1957 (1994).</li><li>Selby, C. P., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription-coupled+repair+and+human+disease.">Transcription-coupled repair and human disease.</a> J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).</li><li>Liu, B., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+transcription-repair+coupling+factor.+I.+Structural+domains+and+binding+properties.+Head-on+collision+between+a+DNA+replication+apparatus+and+RNA+polymerase+transcription+complex.">Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex.</a> Science. 267, 1131-1131 (1995).</li><li>George, D. L., Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+excision+repair+in+an+mfd+mutant+of+Escherichia+coli+B/r.">Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r.</a> Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).</li></ol>

Lavare il complesso allungamento fermato legato ai talloni con sale alto è fondamentale al fine di rimuovere qualsiasi instabili o non specificamente molecole RNAP legato. RNAP ha un&#39;affinità molto elevata per le strutture di tipo iniettore-stampo di DNA. Quindi, è necessario rimuovere tale non specifici RNAP-DNA complessi al fine di eseguire la replica dal primer-template. Concentrando la radio prodotti contrassegnati con la purificazione del DNA Qiagen PCR kit è critica anche al fine di ottenere un elevato rapporto segnale sufficientemente radioattive che possono essere osservati nel gel.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dynabeads M-270</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>653.05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SapI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>R0569S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Quick Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>M2200S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCR Purification Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

direct restart of a replication fork stalled by a head-on rna polymerase

Gli studi in vivo suggeriscono che le forcelle replica vengono arrestati a causa di incontri con testa alta complessi trascrizione. Eppure, il destino del replisoma e RNA polimerasi (RNAP) a seguito di una collisione frontale è sconosciuta. Qui, troviamo che la E. coli bancarelle replisoma su collisione con uno scontro complesso di trascrizione, ma invece di crollare, la forcella di replicazione resta altamente stabile e riprende alla fine allungamento dopo lo spostamento del RNAP dal DNA. Troviamo anche che la trascrizione di riparazione fattore di accoppiamento, DM, promuove riavviare diretta della forcella a seguito della collisione, facilitando lo spostamento del RNAP. Questi risultati dimostrano la stabilità intrinseca dell&#39;apparato replica e un ruolo nuovo per la trascrizione accoppiati percorso riparazione nella promozione di replica passato un blocco RNAP.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase at JoVE.com

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

Il destino del replisoma a seguito di una collisione con un testa-a RNA polimerasi (RNAP) è sconosciuta. Troviamo che le bancarelle replisoma su collisione con uno scontro RNAP, ma riprende allungamento dopo lo spostamento del RNAP dal DNA. MFD promuove riavviare la replica, facilitando lo spostamento del RNAP dopo la collisione.

Riavviare diretta di una forchetta di replica in stallo da un Head-On polimerasi RNA

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Ricerca

Biologia

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

Consegna diretta di Morpholinos MIF Into the Otocyst Zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dell&#39;orecchio interno

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

Trascrizione in vitro e tappatura mRNA Luciferase Gaussia Seguito da cellule HeLa Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolamento dell&#39;RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Sviluppo di un Quantitative ricombinasi Polymerase Amplificazione Assay con un controllo positivo interno

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Indurre un blocco di replica siti specifici in<i&gt; E. coli</i&gt; Utilizzando un sistema fluorescente Repressor Operator

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...