Name: direct restart of a replication fork stalled by a head-on rna polymerase
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00
Duration: 7 min 27 s
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我々は、RNAPとMFDタンパク質および発現ベクターを提供するためのセスダーストに特に感謝しています。我々はまた、技術サポートのためにGreBとダン張を提供するためのセルゲイBorukhovに感謝している。この作品は、国立衛生研究所（MOD）からの助成金によって、ロックフェラー大学（RTP）でマリー=ジョゼとヘンリークラビスフェローシップでサポートされていました。

このメソッドは、で報告された研究で使用され<a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">ポメランツとオドネル、科学327、590〜592（2010） 。</a> 1。停止RNAPの伸長複合体のアセンブリは、以下のように行った： E.の500nMの最終濃度大腸菌の RNAポリメラーゼは、HEがバッファー100μl中T7A1プロモーター（20mMのトリス- Cl（pH7.5）中、8 mMのMgCl 2、0.5mMのEDTA、5を含むビオチン化3.6キロバイトのDNAテンプレートの5nMの最終濃度と混合された70、σ 37℃で10分のためmMのDTT、10％グリセロール） APUの100μMおよび40μMGTP、ATP、およびCTPのそれぞれが37℃でさらに10分間添加した℃、 2。ストレプトアビジンビーズ上に停止したRNAポリメラーゼの伸長複合体の固定化は、以下のように行った： ストレプトアビジン磁気コーティングされたビーズ（Invitrogen社）を200μl室温で10分間、上記の反応に加えた。 3。固定化停止RNAPの伸長複合体の精製は以下のように行った： ビーズ（上記から）、次のバッファ0.9 mLで含む、0.75MのNaCl、200μg/ mlのヘパリン、および20μg/ mlのssDNAを（上清を磁気分離することにより、各洗浄ステップの後に削除されました。）5回洗浄し、ビーズを緩衝液Aの0.9 mlで2回洗浄し、 4。 ：に正面からRNAP次のように実行された下流の相対的な複製フォークの形成ビーズ（上記から）ニューイングランドバイオラボバッファ4と樹液私の10ユニット（New England Biolabs社）100μlに再懸濁し37℃で10分間追加されました℃にビーズをバッファー0.9 mLで3回洗浄し、次にクイックT4ライゲーション反応バッファー（New England Biolabs社）を50μlに再懸濁した。クイックT4リガーゼ（New England Biolabs）2μlを室温で10分間プレアニーリングしたフォークDNAの6nmの最終濃度（RP10、RP22、RP25）と一緒に追加されました。ビーズを緩衝液Aの0.9 mlで3回洗浄し、 5。複製フォークでreplisomeとリーディング鎖合成の開始のアセンブリは、以下のように行った： DnaB 448 pmolのは（量体として）30秒のバッファを150μl（20mMのトリス- Cl（pH7.5）中、8 mMのMgCl 2、0.5mMのEDTA、5mMのDTT、10％グリセロール）でビーズとインキュベートした23℃ポリメラーゼIIIの4.9 pmolの*（はPol III HEマイナスβ）、βの15 pmolの、2mMのATP、60μMdGTP及びdATPのそれぞれを200μlの体積に添加し、37でさらに5分間℃にインキュベートした。レプリケーションは、と一緒に10μgのSSBと24μMのdATPとdTTPの各々を加えることにより開始された[α- 32 P] dTTPのと[α- 32 P] dCTPを（特定の活動、3,000〜5,000 CPM / pmol）を250の最終容量にμL。反応は、500mMのEDTA 12μLを加える時に10分後に終了した。 6。放射性標識DNA産物の精製および濃縮は次のように行った： 反応は、ビーズからDNAを除去するために終了した後、ビーズを（上から）煮沸した。ビーズに接続されている残っている残存DNAを50℃で30分間、10 ulのボリュームでプロテイナーゼKとビーズを処理することにより削除されました℃にビーズを沸騰させ、上清を磁気分離により除去した。 DNAを含む組み合わせて上清をQiagen PCRクリーンアップキットを用いて精製した。精製された放射性標識DNA産物をアルカリアガロースゲルで分析した。 ヘッドオンRNAP伸長複合体が上記のように実行された停止、しかし、σ70の存在下で*レプリケーションが省略されていました。 代表的な結果： とreplisomeの正面衝突でRNAP通常2.5 kbおよび長さは3.6 kbの二つの製品につながる。 2.5キロバイトの製品は、フォークから停止RNAPとRNAポリメラーゼとの衝突時に失速replisomeから結果へのDNAの長さを表します。 3.6キロバイトの製品は、不完全なRNAPによるプロモーターの占有または部分的replisomeヘッドオンRNAPのリードスルーのどちらかから完全長のDNAとの結果を表しています。いいや、正確な結果が約50％の完全長DNAが生成されていることを示しています。ただし、場合によっては、RNAPによるプロモーターの少ない占有が発生し、replisomesの大きい人口がヘッドオンRNAPが発生しないので、完全長のDNAの割合が高いが観察される。唯一の完全長DNA（3.6 KB）の停止RNAPの結果がない場合に複製。 <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="図1" /> 図。 1 replisomeは、ヘッドオンRNAPによって妨げられている。 （A）実験のセットアップ。 E.コル私は停止伸長複合体は、前述のようにT7A1プロモーターを含むビオチン化DNA（9）にアセンブルされたRNAP。簡単に言えば、停止伸長複合体は、さらに10分間APU、GTP、ATP、およびCTPを加えて10分間、ビオチン化DNAとRNAポリメラーゼホロ酵素をインキュベートすることにより、プロモーターから20 bpsの下流に形成された。ストレプトアビジンビーズは、ビーズをバッファー0.9 mlのは、不安定なRNAP - DNA複合体と過剰のNTP削除するには、0.75MのNaCl、200 mg / mlのヘパリン、および100nMの一本鎖DNAを含むで5回それぞれ洗浄し、さらに10分間追加されました。 DNAを洗浄し、SAPIで消化し、プレアニーリングしたフォークDNAに連結した。ビーズをreplisomeの組み立て前に再度洗浄した。プロモーターは、フォークから2.5 kbの位置とフォークに向かって直接転写を指向しているさ。DnaBが追加された（B）その後replisomeがアセンブルされ、複製が存在する（レーン2）または非存在下（レーン1）のいずれかで開始されたヘッドオンRNAP。

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高塩濃度でビーズに結合した停止伸長複合体を洗濯しても不安定になったり、非特異的に結合したRNAポリメラーゼの分子を除去するために重要です。 RNAPは、プライマーとテンプレートの型のDNA構造のための非常に高い親和性を持っています。したがって、プライマーテンプレートから複製を実行するために、そのような非特異的RNAP - DNA複合体を除去する必要がある。キアゲンPCR精製キットを用いて放射性標識DNA産物を集中するとゲルで観察することができる十分に高い放射性シグナルを得るためにも重要です。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dynabeads M-270</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>653.05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SapI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>R0569S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Quick Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>M2200S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCR Purification Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

direct restart of a replication fork stalled by a head-on rna polymerase

in vivo試験で複製フォークが原因でヘッドオン転写複合体との遭遇に逮捕されていることを示唆している。まだ、正面衝突に続くreplisomeとRNAポリメラーゼ（RNAP）の運命は不明である。ここで、我々は見つけることE.大腸菌ヘッドオン転写複合体ではなく、崩壊のとの衝突時にreplisome屋台は、複製フォークでは非常に安定していると最終的にDNAからRNAポリメラーゼを置換した後、伸長を再開します。我々は、転写修復カップリング係数、MFDが、RNAPの変位を容易にすることによって衝突の後のフォークの直接の再起動を促進することをも見つける。これらの知見は、複製装置の固有の安定性とRNAPのブロックを越えて複製を促進する転写共役修復経路のための新たな役割を示しています。

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Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

ヘッドオンRNAポリメラーゼ（RNAP）との衝突に続くreplisomeの運命は不明である。我々は、DNAからRNAポリメラーゼを置換した後、伸長をreplisomeヘッドオンRNAPとの衝突時に屋台が、再開することを見つける。 MFDは、衝突後のRNAPの変位を容易にすることによって、レプリケーションの再起動を促進する。

ヘッドオンRNAポリメラーゼによって停止した複製フォークの再起動を指示する

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA ...

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

生物学

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

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We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

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RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

注射とエレクトロポレーションによりゼブラフィッシュ耳胞イントゥMIFモルフォの直接配信は、内耳の開発に影響を与える

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

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HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

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RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

マウス膵臓からのRNAの単離：リボヌクレアーゼが豊富な組織

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

内部陽性対照との定量的リコンビナーゼポリメラーゼ増幅アッセイの開発

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中<i&gt; E。大腸菌</i&gt;蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...