Name: tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis at JoVE.com

Detta arbete har finansierats med bidrag från Forskning kring att förebygga blindhet (Career Development Awards MEZ och alkohol samt en obegränsad bidrag till Ögonkliniken), E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ och ASV) och National Eye Institute / NIH (MEZ , bidrag R01EY015748 och R01EY017964).

Del I. Set-up för ACT-analys <ol><li> Generera utjämnade RNA för injektion som föreslås av tillverkaren, som använder sin fenol: kloroform reningsmetod (t.ex. mMessage mMachine Kit, Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA kodar ett fluorescerande protein används som spårgas. Vi transkribera antingen gula fluorescerande protein (YFP) eller mCherry 5 cDNA, som är i en pCS2 + uttryck vektor. </li><li> Dra borosilikatglas kapillärrör att bilda koniska glas tips med hjälp av en mikropipett avdr...

<ol>
	<li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin,+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin.">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li><li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+in+Developmental+Biology:+Xenopus+&#38;+Zebrafish.">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus &#38; Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , (1999).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li></ol>

I den här filmen har vi visat vår version av klassiska tekniker som används av Xenopus biologer, som vi arrangeras för att skapa djuret analysen locket transplantation. Vid rumstemperatur Xenopus embryon utvecklas mycket snabbt genom olika stadier 9 och 15. Genom att placera dem vid 14 ° C, utvecklingen av embryot är långsammare och många fler transplantationer kan utföras i ett experiment. Om det är nödvändigt att växa de embryon som äldre stadier (&gt; 42/43), då rekommenderar vi att a...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mMessage mMachine SP6 Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems/Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FHC, Inc</td>
<td>27-30-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Inc.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BW17-528Z</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard/elastomer Kit 1.1lb</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9644388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>human chorionic gonadotropin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet</td>
<td>22219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pico-Injector Microinjection Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>650003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-680-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krackeler</td>
<td>6290-20635A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumostar #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis

Många proteiner spelar en dubbel roll i embryots utveckling. De som reglerar determination cellen öde i en specifik vävnad kan också påverka utvecklingen av en större region i embryot. Detta gör att definiera sin roll i en viss vävnad svåra att analysera. Till exempel,<em&gt; Kortling</em&gt; Överuttryck i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryon gör att utbyggnaden av hela främre regionen, inklusive ögat<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Från detta resultat, är det inte känt om Noggin spelar en direkt roll i ögat beslutet, eller att genom att orsaka en expansion av nervvävnad, Noggin indirekt påverkar ögat bildas. Med denna komplexa fenotyp gör att studera dess öga-specifika roll i cellernas öde beslutsamhet svåra att analysera. Vi har utvecklat en analysmetod som överbryggar detta problem. Med utnyttjande av pluripotenta natur<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Djur CAP<sup&gt; 3</sup&gt; Har vi tagit fram en analys för att testa förmågan hos genen produkt (er), som<em&gt; Kortling</em&gt; Eller ögat fältet transkriptionsfaktorer (EFTFs), att förvandla kapsyler till viss vävnad eller celltyper genom att transplantera denna vävnad på sidan av embryot<sup&gt; 4</sup&gt;. Även om vi har hittat antingen Noggin protein behandling eller en samling av transkriptionsfaktorer kan avgöra näthinnans celler öde i djur mössor, kan detta förfarande användas för att identifiera genen produkt (er) inblandade i att ange andra vävnader också.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis at JoVE.com

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps överuttryck genen produkt (er) transplanteras till flanken av att utveckla<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryon i syfte att fastställa om vävnaden bestäms.

Tissue Fastställande Använda Transplant Animal Cap (ACT) analys i Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Research

JoVE Journal

Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Dissekering av Organizer och Animal explants Pole från Xenopus laevis Embryon och församlingen i en cell Adhesion analys

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plast inbäddning och Sektionering av Xenopus laevis embryon

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Skaffa Ägg från Xenopus laevis Kvinnor

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Upprättande och fraktionering av Xenopus laevis Egg Utdrag

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Mikroinjektion av Xenopus laevis oocyter

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

Bröst Epithelial transplantationen

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell imaging och kvantitativ analys av embryonala epitelceller i Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Produktion av Transgena Xenopus laevis Genom begränsning enzymmedierad Integration och Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Ansikts Transplantationer i<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryon

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

Dissekering av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest för<em&gt; In vitro</em&gt; Explantation kultur eller<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...