Name: analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00
Duration: 15 min 35 s
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作者要感谢他们的严格审查，并为他们贡献的手稿沙龙组的成员。我们Morasha和Bikura方案，以色列科学基金会（批准号：1823至1807年和378/08），约瑟夫科恩密涅瓦生物膜研究中心，翟氏父子家庭研究员新科学家计划，亚伯拉罕的支持表示感谢索尼娅Rochlin基金会，欧胜家庭慈善信托基金的海伦和米尔顿答Kimmelman中心生物分子结构及组装;什洛莫和萨宾Beirzwinsky房地产; Meil​​德波顿Aynsley，和Karen暹粒，英国。我们非常感谢给我们的凝集素变种样本丹陶菲克和伊塔马尔Yadid。

第1部分：纳流电喷雾离子镀金毛细血管的制备非共价复合物的分析通常是由纳流电喷雾电离（nESI）6，使用玻璃或石英毛细管已拉至一个精尖（〜1微米内径），并涂有导电材料（通常是黄金） 。这样的毛细血管提供现成的使用从商业来源（新目标或Proxeon）;但是，它可以更具成本效益的准备他们在内部： <ol><li>坚持两个带一个双面胶的培养皿中，相距2厘米的底部垫。垫的中心放置一个玻璃棒（8厘米× 5毫米）。胶粘剂垫将于毛细血管，玻璃棒将支持准备的毛细血管，不断突破（图1）的提示。 </li><li>使用硼硅玻璃毛细管，1.0 mm外径× 0.78 mm内径（我们从华纳仪器使用500薄壁硼硅毛细血管包，猫没有。G100TF - 4）。插入一个毛细管进针拉马（我们从萨特仪器有限公司使用的P - 97型）。夹紧毛细管轻轻到位，并调整其位置，使其针拔取器的加热丝的中心所在。轻轻拧紧夹子，直到毛细管两端举行的公司。 </li><li>拉毛细管，使用预定义的程序。每一个毛细管拉会带来两个决赛中，形毛细血管。拉马编程过程的试验和错误之一，直到获得一个可以接受的笔尖形状。我们使用下列程序： <table border="1"><tbody><tr><td> 步骤 </td><td> 热 </td><td> 拉 </td><td> Vell </td><td> 时间 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li>从仪器上取出拉的毛细血管和检查提示，丢弃任何变形或折断。使用钝镊子（我们使用从CK精密定位镊子），放置在培养皿中的毛细血管。基地应重视的毛细血管胶粘剂垫，上部尖朝上，靠在玻璃棒。 </li><li>一旦培养皿满（约80毛细血管成一个直径10厘米的菜适合），插入黄金板块溅射镀膜机（我们使用的模型。EMS550，从环境管理体系）。确保的天然气供应，是根据制造商的指示选择，并激活一个预定义的涂层周期（我们使用氩气压力4磅，在5 × 10 -2毫巴，45毫安目前的真空压力，和涂时间3-6个周期，1分钟，直到毛细血管均匀的黄金）。 </li></ol>第2部分：样品制备<ol><li>微摩尔浓度低的样品（1 - 20微米）。如果有必要，集中使用离心超滤装置（例如，Vivaspin赛多利斯，或NanoSep Pall公司）的样品。建议您验证设备膜蛋白复合物吸附，方可使用。 </li><li>通常情况下，纯化的蛋白复合物的缓冲区或存储解决方案nESI，只有不稳定的解决方案可用于不兼容。因此，缓冲区的交流是必要的。盐，缓冲分子或任何其他非易失性的加合物，如甘油，数码地面电视服务，或EDTA的所有痕迹都将被删除，这关键的一步，决定了光谱的质量。通常情况下，使用醋酸铵水溶液，浓度在5毫米和1米之间，pH值在6-8。缓冲交换，可使用微量凝胶过滤柱（如微型生物自旋层析柱来自Bio - Rad）。此步骤可重复，以最小的稀释1-3倍（小于1.3每台设备的 5倍），直到达到最大交换。如果这两个浓度和缓冲交流是必需的，这可能是一起做，用离心超滤（E，G.，从德国赛多利斯Vivaspin，或NanoSep从Pall公司）。 </li></ol>第3部分：高质量测量的校准质谱仪多蛋白复合物进行实验，大部分是使用了纳米电四极杆 - 飞行时间（Q - TOF）仪器。建议您使用四极杆质量过滤器调整到低频率，使传输和质量分析离子与高m / z值7,8。这是还建议，添加到仪器的进气口7,8或袖子9中第一个离子指 ​​南，在第一个真空阶段，使压力控制。后者使优化的传输，和非常大的离子7-9脱溶剂。目前，商业ESI - TOF和Q - TOF仪器，可从几个制造商（例如，水域，SCIEX公司，布鲁克，或Agilent），可以修改相对容易和成本效益为母语的MS 应用 7,8， 。这是可能的，但是，使用标准TOF或QTOF配置LCT或QToF1（水域）等仪器获得配合物高达1 MDA的质谱，而不需要修改硬件 5 。 下面列出的协议进行了一个SYNAPT仪器（水域）。 <ol><li>纯净水，准备沪深100毫克/毫升的解决方案。 CSI是用于高质量校准，作为单独收取的盐集群（CSI）ñ 铯 +延长超过一个广泛的群众范围内，从393米/ Z以及超过10,000（图2）。 </li><li>使用生硬的镊子，从培养皿和沪深解决方案的负载2μL涂层的毛细管进入毛细血管，使用的Eppendorf GeLoader提示。 </li><li>插入毛细管持有人的毛细血管，并调整这样一种方式，提示是远离持有人的边缘约10毫米的毛细管。 </li><li>手动滑动对毛细管的尖端解决方案，或使用一个自旋向下适配器。 </li><li>置于光学显微镜下的毛细血管和修剪技巧，用锋利的AA型镊子。 </li><li>将毛细管持有人的纳流ES接口。向后旋转XYZ阶段，以避免损坏毛细管，推入其激活的阶段。毛细管应放在第1 - 10毫米锥孔。 </li><li>应用毛细管电压（1450至00年V）和纳流压力低（0.00-0.03栏），直到开始喷，然后尽量减少到最低值的纳流压力。 </li><li>优化调整XYZ阶段的位置，毛细管电压，纳流压力，并脱溶剂气流量的信号强度。 </li><li>要检测的CSI高峰系列宽的质量范围，应优化加速电压（我们使用下列参数：毛细管1.3-1.7千伏，样品锥，锥提取1-3 V 80 - 150V）。 </li><li>为了优化高的质量离子的传输，这就需要温和的去溶剂化条件下，在最初的真空阶段为后盾压力源和分析仪之间，，应提高。这可以通过仔细地减少滚动泵源真空线的电导，部分关闭隔离阀（Speed​​iValve）。为了确定最佳点，后者应该做的，同时监测信号强度（我们通常使用3.0-6.5毫巴）的效果。 </li><li>收集1次/秒扫描约30，在1000到15000米/ Z m / z为范围</li><li>收购完成后，校准的飞行时间，使用合适的校准表。 </li></ol>第4部分：完整的蛋白质复合物的质谱分析<ol><li>载入您的样品，（第3部分，第2-5节），并启动喷雾。 </li><li>喷雾的初步优化（第3部分，第6-9）开始，直到检测到的信号。电荷态的确切位置是蛋白依赖，但是，它可以预测，使用离子的质量和平均电荷态之间的关系，从而：（Z AV）10 位 ：Z AV = 0.0778√（M） ，其中m道尔顿复杂的质量。为了防止复杂的解离，不热离子源：开关加热器关闭，或保持温度低于40 ° C。 </li><li>改变毛细管的位置，样品锥和提取电压，以最大限度地提高离子传输，并检查在光谱产生变化。一个可能的出发点可能是锥孔电压100伏，提取锥：1 V，毛细管电压为1.5 kV。优化这些参数，结合纳流压力。 </li><li>为了提高脱溶剂，去掉残留的水和缓冲液成分，增加偏置电压和碰撞单元中的气体压力。这一步应该认真执行，以防止分解的复杂。典型的偏置电压10-100 V的范围内，用1-10毫升/分钟（图3）的陷阱气体流量。手动调节的RF设置和四极剖面可提高传输高质量离子。 </li><li>调整陷阱和转让碰撞能量。通常情况下，需要更高的电压传输高质量离子（通常是10-30 V的范围内）。在这一点上，重要的是要避免碰撞诱导解离的复杂。 </li><li>后一个稳定的信号是Reached，建议纳流压力和毛细管电压下降到最小值，同时保持了稳定的喷雾。 </li></ol>第5部分：串联质谱：游离蛋白复合物<ol><li>已获得最佳的和稳定的信号后，选择一个母离子。设置质量中心和隔离宽度（我们一般用12的LM决议，航模的13至15号决议）。使用宽的质量范围检测高质量/低电荷分解产品。建议您设置的m / z范围内的最高水平，然后降低到所需的值。我们进一步建议叠加MS和MS / MS谱图，以验证所选择的母离子的隔离。 </li><li>要执行的MS / MS，游离于母离子碰撞池的碰撞能量（CE）和压力增加。增加任何陷阱，或逐步转移行政长官在10 - 20V的步骤，和碰撞气体压力提高到0-5毫升/分钟（共同价值观）。最佳激活条件监视器中的光谱变化，直到达到。高活化能可能诱发的一个或多个完整复杂的亚基的解离，并澄清不同的亚基相互作用的亲和力。我们通常使用氩气作为一个陷阱/转移细胞的碰撞气体，虽然已使用较重的气体（如氙或 SF 6）的好处，但是，这些气体都比较昂贵11（图3）。 </li><li>建议选择MS / MS分析一个以上的充电状态。在重叠组件的情况下，购置了一套串联质谱图，将有助于解决不同人群的负责系列。此外，高电荷态会更容易游离于相比，降低电荷态12。 </li><li>除了完整复杂的特征，它会产生较小的解决方案subcomplexes，轻度变性条件下。 subcomplexes的MS和MS / MS分析的形式定义的复杂的亚基 13结构的基础上。亚基亚基相互作用的部分中断，逐渐添加有机溶剂（如甲醇，异丙醇或乙腈）的浓度为50％，或改变溶液的pH值，加入氨甲酸（浓度的4 ％）。 </li><li>要确定的亚基组成的复杂的个人群众，重要的是要变性条件下获得的频谱。这可以使用Zip提示一个25:75的水/乙腈比例 C 4（Millipore公司）作为洗脱溶剂的1％的甲酸，开展。 </li></ol>第6部分：数据处理与分析<ol><li>数据进行离线分析，使用MS谱的谱分析程序。我们通常使用的MassLynx方案（水域）。 </li><li>跨越广泛的m / z范围的光谱，我们建议的高与低的m / z地区应用平滑和质心参数不同的方案，以反映在这些地区的高峰决议的差异。 </li><li>要确定充电系列和计算电荷态和群众，“手册”MassLynx功能可以应用。在复杂的质谱重叠组件的情况下，群众的手工计算可能会更容易。 </li><li>为了方便这些分配过程，可能是额外的软件，例如：MAXENT谱反褶积14峰拟合和模拟15 SOMMS，和分配的组成和化学计量学和蛋白subcomplexes生成蛋白质相互作用网络13,16,17首脑会议。 </li></ol>第7部分：代表结果<img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="图1" /> 图1。准备金涂层纳米电毛细血管。 A.将两个双面胶带到培养皿中，相距2厘米。为了支持准备毛细血管，放置在垫中心玻璃棒（8厘米× 5 mm的）。棒的钝端的准备毛细血管胶粘剂垫，和精益的玻璃棒上的一角。 C.一旦培养皿中充满了黄金与毛细血管的准备，他们的外衣，直到黄金薄膜是均匀分布的毛细血管外表面沉积。 <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="图2" /> 图2。使用碘化铯离子的质量校准 。 沪深大monisotopic集群有它的首选校准质谱仪质谱分析高的复合。等距峰系列扩展到范围很广，远远超过m / z为393万。他们是assigNED单独收取的一般组成（CSI）N CS +盐集群。主要山峰之间的附加 ​​信号的系列双重和三重收取物种造成的; [（CSI）N CS2] 2 +和[（CSI）N CS3] 3 +分别。增加在最初的真空阶段压力检测高大规模集群至关重要。高质谱峰的压力的影响是在小组的一个表现。 和 B。与压力分别为1.2和5.3，readbacks，C 。 在 B扩大质谱。 <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="图3" /> 图3。纳流电的一个五聚体的外源凝集素的质谱。 A.一个外源凝集素的变异复杂的质量法（ 定向进化18 LIB1 - B7所得）上升到3000至5000米/ Z的电荷态分布，但由于离子的不足，脱溶剂，峰广阔。比较显示面板a.和b.增加偏置电压从4V（A）（B）的峰宽至15V的效果。这在加速条件下的增加会导致残留的水和缓冲液成分剥离，产生了高度分辨谱。测得的质量（60240 ± 38大）对应一个五聚体复杂。C. 15充电状态，然后选择串联质谱分析（在B组以灰色阴影。）D。在碰撞能量的增加导致在1,664 m / z为中心的高电荷的单体，和一个精简的四聚体复合物的释放，范围在5000 - 8000米/ Z所有的光谱，获得一个解决方案，20微米的样本含有0.5M醋酸铵。

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为了获得高品质的光谱应注意的样品制备步骤，其中包括样品的浓度和缓冲交换。稀释的样本，将产生一个低信号，而高度浓缩的样品可以而粘稠，并阻止电针。此外，解决方案，如盐，甘油，洗涤剂，金属离子和还原剂（DTT或β-巯基乙醇）添加剂，往往坚持的外表面的蛋白质，并导致扩大峰。因此，为了实现良好的解决峰，这些组件应在尽可能低的浓度增加。 另一个关键参数是纳升级毛细管的位置，相对质谱仪口。寻找“甜蜜点”可能是对没有经验的用户具有挑战性的，不过，它显着影响光谱的质量。同样重要的是检查纳流毛细管前开始喷。墨滴的大小是一个尖端直径，这应该是〜1μm的的功能。小水滴会导致更有效的电离，因此将是有利的。验证，毛细血管内有没有气泡，可以阻止流动同样重要的是，和黄金涂层不剥离从收购过程中的毛细血管;若有，进一步修剪技巧。请记住，一个样品过量会增加优化MS条件，如毛细管电压，加速电压，压力，碰撞能量的可能性。 总体而言，在协议中所解释的程序已被用于确定大量的蛋白质复合物的成分，化学计量学和结构（见评论2,3,4）。 MDA的大型复合物， 如核糖体的19 高度有序的病毒衣壳20-22，分析，确定底物结合的分子机器23-25 ​​日， 或亚基相互作用网络的特性26,17,16,17,27,28作为但这种方法的价值的几个例子。

样品要求： <table border="1"><tr><td> 样品 </td><td> 要求 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td>卷</td><td> 1-2微升</td><td>每毛细管</td></tr><tr><td>集中</td><td> 1 -20μM </td><td>每个联合体</td></tr><tr><td>缓冲区</td><td> Aquanos挥发，如醋酸铵缓冲在pH = 6 - 8 </td><td>通常情况下5毫米- 1M </td></tr><tr><td>洗涤剂</td><td>最小</td><td>洗涤剂分子团簇产生广泛和尚未解决的的峰</td></tr><tr><td>甘油</td><td>最小（高达5％） </td><td>坚持非特异性的蛋白质，因此，宽峰观察</td></tr><tr><td>有机溶剂</td><td>高达50％ </td><td>可能变性蛋白复合物</td></tr><tr><td>酸</td><td>高达4％ </td><td>变性蛋白复合物</td></tr><tr><td>盐</td><td>最小</td><td>盐加合物导致广泛和尚未解决的的峰</td></tr><tr><td>数码地面电视</td><td>最小</td><td>可存在1-2μM </td></tr><tr><td>螯合剂</td><td>最小</td><td> 250微米以上，导致广泛的加合物的形成</td></tr></table>

analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry

活细胞控制和调节生物过程，采取协调一致的行动，通过大量的蛋白质，自己组装成一个阵列的动态，多蛋白质复合物 1 。为了获得各种细胞过程的机械理解，它是至关重要的，以确定这种蛋白复合物的结构，并揭示其组织结构如何决定其功能。多蛋白质复合物的许多方面，但是，难的特点，由于其异质性，非对称结构和动态。因此，新的方法所需的蛋白质组织的三级研究。 新兴的分析大分子复合物的结构生物学工具之一，是质谱（MS）2-5 。这种方法产生复杂的蛋白质组成，亚基的化学计量，和结构拓扑信息。 MS的权力来自其高灵敏度，作为一个结果，样品要求低，从而使内源性水平表达的蛋白质复合物的检查。另一个优点是分析速度，它允许实时反应监测。此外，该技术可以同时测量的特点共存的混合物中单独的人群。 在这里，我们描述了一个详细的协议结构MS分析大蛋白组件的应用程序。程序开始与纳流电喷雾电离（nESI）准备金涂层毛细管。然后，它继续与样品制备，强调一方面应与nESI兼容，并能保持复合物上的其他完好的缓冲液条件。然后，我们解释，一步一步，如何优化高质量测量的实验条件，并获得MS串联质谱图。最后，我们图表中的数据处理和分析，遵循的。而不是试图来描述蛋白质装配的每一个方面，这个协议是介绍了基本的MS程序，使非共价复合物的MS和MS / MS实验的表现。总的来说，我们的目标是提供的主要实验工具的知识，不了解结构MS领域的研究人员。

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Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

质谱法已被证明是一个有价值的工具，用于分析大型蛋白质复合物的。这种方法使多亚基组件组成，化学计量学和整体结构的见解。在这里，我们所描述的，一步一步，如何执行一个结构性的质谱分析，和特性的大分子结构。

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