Name: analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00
Duration: 15 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

De auteurs bedanken de Sharon leden van de groep voor hun kritische review, en voor hun bijdrage aan het manuscript. We zijn dankbaar voor de steun van de Morasha en Bikura Programma&#39;s, de Israel Science Foundation (Grant nrs. 1823-1807 en 378/08), de Josef Cohn Minerva Centrum voor biomembraan onderzoek, de Chais Family Fellows Program voor New Scientists, de Abraham en Sonia Rochlin Foundation; de Wolfson Family Charitable Trust, het Helen en Milton A. Kimmelman Centrum voor Biomoleculaire Structuur en assemblage, het landgoed van Shlomo en Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, en Karen Siem, Verenigd Koninkrijk. We zijn dankbaar Dan Tawfik en Itamar Yadid voor het geven van ons de lectine variant monster.

Deel 1: Voorbereiding van goud gecoate capillairen voor nanoflow electrospray ionisatie Analyse van niet-covalente complexen wordt meestal uitgevoerd door middel van nanoflow electrospray ionisatie (Nesi) 6, met behulp van glas of kwarts haarvaten die zijn getrokken om een fijne tip (~ 1 micrometer inwendige diameter), en gecoat met een geleidend materiaal (meestal goud) . Dergelijke haarvaten zijn kant-en-klare uit commerciële bronnen (nieuwe doelstelling of Proxeon), maar het kan meer kosten-effectief om hen voor te bereiden in-huis: <ol><li> Stok twee stroken van een dubbelzijdig klevende pad naar de bodem van een petrischaal, 2 cm uit elkaar. Plaats een glazen staaf (8 cm x 5 mm) in het centrum van een van de pads. De lijm pad houdt de haarvaten in de plaats, en de glazen staaf zal de haarvaten voorbereid, en houden de tips uit te breken (afb. 1). </li><li> Gebruik borosilicaatglas haarvaten, 1,0 mm x 0,78 mm OD id (we gebruiken verpakkingen van 500 dunne wand borosilicaat capillairen van Warner Instruments, cat. Nee. G100TF-4). Plaats een capillair in de naald trekker (we gebruiken model P-97 uit de Sutter Instrument Co). Voorzichtig klem de capillaire op zijn plaats, en pas de positie, zodat het ligt in het centrum van de verwarming van de naald trekker van de gloeidraad. Draai voorzichtig de klemmen, totdat de capillaire is beursgenoteerd bedrijf aan beide uiteinden. </li><li> Trek het capillair, met behulp van een vooraf gedefinieerde programma. Getrokken iedere capillaire zal aanleiding geven tot twee laatste, de vorm van haarvaten. Het proces van programmeren van de trekker is een van de trial-and-error, tot een aanvaardbaar tip vorm wordt verkregen. We maken gebruik van het volgende programma: <table border="1"><tbody><tr><td> Stap </td><td> Warmte </td><td> Trek </td><td> Vell </td><td> Tijd </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Haal de getrokken capillairen van het instrument en inspecteer de tips, waarbij een eventueel dat misvormd is of gebroken. Gebruik stomp pincet (we gebruiken positionering pincet uit CK Precision), naar de haarvaten in de petrischaal. De basis van de capillaire moet worden gehecht aan de lijm pad en het bovenste deel moet steunen op de glazen staaf, met de punt naar boven. </li><li> Zodra de petrischaal vol is (ongeveer 80 haarvaten passen in een 10 cm diameter schotel), plaatst de plaat in het goud sputter coater (we gebruiken het model niet. EMS550, van EMS). Zorg ervoor dat de gastoevoer wordt gekozen volgens de instructies van de fabrikant, en activeer een vooraf gedefinieerde coating cyclus (we gebruiken Argon druk 4 psi, bij een vacuum druk van 5 x 10 -2 mbar, een stroom van 45mA, en een coating tijd van 1 min, voor 3-6 cycli, totdat de haarvaten zijn gelijkmatig gouden). </li></ol> Deel 2: Voorbereiding van het monster <ol><li> Lage micromolaire concentraties van het monster nodig zijn (1 - 20 uM). Indien nodig, concentreer het monster met behulp van centrifugale ultrafiltratie apparaten (bijv. Vivaspin van Sartorius, of NanoSep van Pall Corporation). Het wordt aanbevolen dat u de adsorptie van het eiwitcomplex te controleren om het apparaat membraan voor gebruik. </li><li> Vaak is de zuivering buffers of storage-oplossingen van het eiwit complex zijn niet compatibel met Nesi, waarvoor alleen vluchtige oplossingen worden toegepast. Daarom buffer uitwisseling noodzakelijk is. Deze kritische stap, waarin alle sporen van zouten, buffer-moleculen of andere niet-vluchtige adducten zoals glycerol, DTT, of EDTA worden verwijderd, bepaalt de kwaliteit van de spectra. Meestal wordt waterige ammoniumacetaatoplossing gebruikt, bij een concentratie van tussen de 5 mm en een M, en 6-8 pH. Buffer uitwisseling kan worden uitgevoerd met behulp van een microcentrifuge gelfiltratie kolom (bijv. Micro Bio-Spin 6 chromatografiekolommen van Bio-Rad). Deze stap kan worden herhaald 1-3 keer met minimale verdunning (minder dan een factor van 1,3 per apparaat 5), tot de maximale uitwisseling is bereikt. Als zowel de concentratie en de buffer uitwisseling nodig zijn, kunnen deze samen worden gedaan, met behulp van centrifugale ultrafiltratie (e, g, Vivaspin van Sartorius, of NanoSep van Pall Corporation). </li></ol> Deel 3: Het kalibreren van de massaspectrometer voor een hoge massa-metingen Het merendeel van de experimenten uitgevoerd op multi-eiwit-complexen zijn uitgevoerd met behulp van een nano elektrospray quadrupool-time-of-flight (Q-TOF) instrument. Er wordt gesuggereerd dat u een quadrupool massa filter aangepast aan de lage frequenties te gebruiken, om de overdracht en de massa-analyse van ionen mogelijk met een hoge m / z-waarden 7,8. Het isook aanbevolen dat gasinlaten 7,8 of 9 hulzen worden toegevoegd aan het instrument in de eerste ion gids, om de druk controle mogelijk te maken bij de eerste vacuum fase. De laatste maakt optimalisatie van de transmissie en desolvation van zeer grote ionen 7-9. Op dit moment, commerciële ESI-ToF en Q-TOF-instrumenten zijn beschikbaar van verschillende fabrikanten (bijvoorbeeld, Waters, Sciex, Bruker, of Agilent), die kunnen worden relatief gemakkelijk en kosteneffectief, aangepast voor eigen MS-toepassingen 7,8. Het is mogelijk, echter de standaard ToF of QTOF configuraties te gebruiken op instrumenten zoals LCT of QToF1 (Waters) om de massa spectra te verwerven voor complexen tot een MDA, zonder de noodzaak voor hardware aanpassingen 5. Het protocol hieronder beschreven werd uitgevoerd op een Synapt instrument (Waters). <ol><li> Bereiding van 100 mg / ml, oplossing van de CSI in gezuiverd water. CSI gebruikt voor hoge massa kalibratie van de enkelvoudig geladen zout clusters, (CSI) n Cs + uitstrekken over een breed massa bereik, van 393 m / z tot ruim 10.000 (afb. 2). </li><li> Met behulp van bot pincet, neem een ​​gecoate capillair van de petrischaal en de belasting 2μL van de CSI-oplossing in het capillair, met behulp van een Eppendorf GeLoader tip. </li><li> Steek de capillaire in de capillaire houder, en pas de capillaire op een zodanige wijze dat de tip is ongeveer 10 mm afstand van de rand van de houder. </li><li> Schuif de oplossing naar de top van de capillaire handmatig, of met behulp van een spin down adapter. </li><li> Plaats het capillair onder een optische microscoop en snijd de tip, met behulp van de scherpe AA-type pincet. </li><li> Sluit de capillaire houder aan de nanoflow ES-interface. Achteruit Draai de xyz stadium om te voorkomen dat schade aan de capillaire, en duw het podium in zijn geactiveerd positie. De capillaire moet worden geplaatst 1 - 10 mm van de kegel opening. </li><li> Van toepassing zijn capillaire spanning (1050-1400 V) en een lage nanoflow druk (+0,00 tot 0,03 bar) tot de sproeistof wordt gestart, probeer dan de nanoflow druk te verminderen tot een minimale waarde. </li><li> Optimaliseren van de intensiteit van het signaal door het aanpassen van de locatie van de xyz fase, de capillaire spanning, de nanoflow druk, en de desolvation gasstroom. </li><li> Voor het detecteren van een breed scala massa van CSI piek-serie, moet de versnelling spanningen geoptimaliseerd worden (we gebruiken de volgende parameters: capillaire 1,3-1,7 kV, sample kegel 80-150V, extractie kegel 1-3 V). </li><li> Voor het optimaliseren van de overdracht van hoge massa ionen, die zachte desolvation voorwaarden, de backing druk in de eerste vacuüm fase, tussen de bron en de analysator vereisen, moeten worden verhoogd. Dit kan worden bereikt door zorgvuldig het verminderen van de geleiding van de bron vacuüm lijn naar de scroll pompen, door het gedeeltelijk sluiten van de afsluiter (SpeediValve). Om het optimale punt te definiëren, moet deze worden uitgevoerd, terwijl het toezicht op het effect op de signaalintensiteit (we meestal gebruik van 3.0-6.5 mBar). </li><li> Verzamel ongeveer 30 scans bij 1 scan / sec, op een m / z bereik van tussen de 1.000 tot 15.000 m / z. </li><li> Na de overname, kalibreren van de TOF met de juiste kalibratie tafel. </li></ol> Deel 4: MS analyse van intacte eiwitcomplexen <ol><li> Laad je monster, zoals beschreven (deel 3, afdelingen 2-5), en initiëren spray. </li><li> Begin met de eerste optimalisatie van de spray (deel 3, afdelingen 6-9), totdat het signaal wordt gedetecteerd. De exacte positie van de lading staten is proteïne-afhankelijk, maar het kan worden voorspeld met behulp van de relatie tussen ion massa en gemiddelde tarief staat, dus: (Z av) 10: Z av = 0,0778 √ (m), waarin m is de massa van het complex in Daltons. Om te voorkomen dat complexe dissociatie, niet Verwarm de ionenbron: ofwel schakelt de verwarming uit, of de temperatuur lager dan 40 ° C. te houden </li><li> Varieer de capillaire positie, monster kegel en afzuigkap spanningen aan ion-transmissie te maximaliseren, en controleer de resulterende wijzigingen in de spectra. Een mogelijk uitgangspunt zou kunnen worden cone voltage 100 V; extractor conus: 1 V; capillaire spanning 1,5 kV. Optimaliseren van deze parameters, in combinatie met de nanoflow druk. </li><li> Ter verbetering van desolvation en uit afvalwater en buffer componenten strip, verhogen de bias spanning en de gasdruk in de botsing cel. Deze stap moet zorgvuldig worden uitgevoerd, tot dissociatie van het complex te voorkomen. Typische bias spanningen zijn binnen het bereik van 10-100 V, met een val gasstroom van 1-10 ml / min (afb. 3). Handmatige instelling van de RF-instelling en quadrupool profiel kan het verbeteren van de overdracht van de hoogmis ionen. </li><li> Pas de Trap en de overdracht botsing energieën. Vaak zijn hogere spanningen nodig zijn voor de overdracht van een hoge massa-ionen (meestal binnen de range van 10-30 V). Op dit punt is het belangrijk om te voorkomen dat een botsing veroorzaakte dissociatie van het complex. </li><li> Na een stabiel signaal is reached, is het aanbevolen dat de nanoflow druk en capillaire spanning worden verlaagd tot minimale waarden, met behoud van een stabiele spray. </li></ol> Deel 5: Tandem massaspectrometrie: distantiëren eiwitcomplexen <ol><li> Zodra een optimale en stabiele signaal is verkregen, selecteert u een precursor ion. Stel de massa-centrum en isolatie breedte (we doorgaans gebruik van een LM resolutie van 12, en een HM resolutie van tussen de 13 en 15). Gebruik een brede massabereik aan de hoge massa / het batterijniveau laag is dissociatie-producten op te sporen. Het wordt aanbevolen dat u de m / z bereik in te stellen op het maximale niveau, en dan te reduceren tot de gewenste waarden. We verder stellen superpositie van de MS en MS / MS spectra, aan het isolement van de gekozen precursor ion valideren. </li><li> Voor het uitvoeren van MS / MS, dissociëren de voorloper ion door het verhogen van de botsing energie (CE) en de druk op de botsing cel. Te verhogen ofwel Trap of geleidelijk Transfer CE, in stappen van 10-20V, en verheffen de botsing gasdruk tot 0-5 ml / min (gemeenschappelijke waarden). Monitor veranderingen in de spectra tot een optimale activering omstandigheden worden bereikt. Hoge activatie energie kan leiden tot het uiteenvallen van een of meer subunits van de intacte complex, en verduidelijking van de interactie tussen affiniteiten van de verschillende subeenheden. We gebruiken meestal Argon als een botsing gas in de Trap / Transfer-cellen, hoewel de voordelen van het gebruik van een zwaardere gas (bijv. Xe of SF 6) zijn gemeld, maar deze gassen zijn aanzienlijk duurder 11 (afb. 3). </li><li> Het wordt aanbevolen om meer dan een laadtoestand worden geselecteerd voor MS / MS-analyse. In het geval van overlappende componenten, zal het verwerven van een set van tandem MS spectra te helpen bij het oplossen van de lading serie van de verschillende populaties. Bovendien zal een hogere heffing staten dissociëren gemakkelijker, vergeleken met de lagere kosten staten 12. </li><li> In aanvulling op de karakterisering van de intacte complex, wordt voorgesteld dat de kleinere subcomplexes in oplossing zullen worden gegenereerd, onder milde denaturerende omstandigheden. De MS en MS / MS analyses van subcomplexes vormen de basis voor het definiëren van de subunit architectuur van het complex 13. Voor de gedeeltelijke verstoring van de subunit-subunit interacties, voeg geleidelijk organische oplosmiddelen (bijv. methanol, isopropanol, of acetonitril) tot een concentratie van 50%, of verandering van de pH van de oplossing door het toevoegen van ammoniak of mierenzuur (tot een concentratie van 4 %). </li><li> Voor het bepalen van de massa&#39;s van de individuele subeenheden dat het complex samengesteld, is het belangrijk om een ​​spectrum te verwerven onder denaturerende omstandigheden. Dit kan worden uitgevoerd met behulp van Zip-Tip 4 C (Millipore) met een 25:75 water / acetonitril-verhouding, met 1% mierenzuur als de elutievloeistof. </li></ol> Deel 6: Data verwerking en analyse <ol><li> Gegevens worden geanalyseerd offline, met behulp van een spectraal-analyse programma&#39;s voor MS-spectra. We normaal gesproken gebruik maken van de MassLynx-programma (Waters). </li><li> Voor spectra dat een breed m / z assortiment overspanning, raden wij verschillende regelingen van smoothing en zwaartepunt parameters worden toegepast voor de hoge en lage m / z regio&#39;s, het verschil in piek resolutie van deze regio&#39;s weer te geven. </li><li> Het identificeren van kosten-serie en bereken lading staten en massa&#39;s, de &quot;handleiding vinden&quot; functie van MassLynx kan worden toegepast. In het geval van complexe massaspectra met overlappende componenten, kan handmatige berekening van de massa&#39;s gemakkelijker. </li><li> Om voor deze opdracht processen, kunnen extra software worden gebruikt, bijvoorbeeld: Maxent voor spectra deconvolutie 14, SOMMS voor piek montage en simulatie 15, en top voor het toewijzen van de samenstelling en de stoichiometrie van eiwitten subcomplexes en het genereren van eiwit interactie netwerken 13,16,17 . </li></ol> Deel 7: representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Voorbereiden goud gecoate nano-electrospray haarvaten. A. Bevestig twee dubbelzijdige plakband op een petrischaal, 2 cm uit elkaar. Ter ondersteuning van de voorbereide haarvaten, plaats een glazen staaf (8 cm x 5 mm) in het centrum van een van de pads. B. Steek het stompe eind van de haarvaten bereid om de lijm pad, en leunen de tip over de glazen staaf. C. Zodra de petrischaal is gevuld met het haarvaten, smeer ze met goud tot een dunne film van goud wordt gelijkmatig afgezet op het buitenoppervlak van de haarvaten. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Hoogmis calibratie met behulp van cesium jodide-ionen. De grote en monisotopic clusters van CSI hebben het de verbinding van de keuze voor het kalibreren van massa spectrometers voor een hoge massa-analyse. De reeks van gelijke afstand van elkaar bergtoppen strekken zich uit over een breed scala, van m / z 393 tot ruim 10.000. Ze zijn assigned om alleen te betalen zout clusters van de algemene samenstelling (CSI) n Cs +. Extra signalen tussen de grote pieken worden veroorzaakt door dubbel-en triple-geladen deeltjes van de serie; [(CSI) n CS2] 2 + en [(CSI) n Cs3] 3 +, respectievelijk. Het verhogen van de druk bij de eerste vacuüm fase is essentieel voor het opsporen van de hoogmis clusters. Het effect van druk op de hoge massa pieken wordt gedemonstreerd in Panelen A. en B. met druk readbacks van 1,2 en 5,3, respectievelijk. C. Uitbreiding van het massaspectrum getoond bij B. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Nanoflow electrospray massa spectra van een pentamere lectine. A. Massaspectrometrie van een lectine variant complex (afgeleid van Lib1-B7 door gerichte evolutie 18) aanleiding geeft tot een vergoeding staat verdelingen tussen de 3.000 en 5.000 m / z, maar als gevolg van onvoldoende desolvation van de ionen, de pieken zijn breed. Vergelijking van het paneel A. en B. tonen het effect van het verhogen van de voorspanning spanning van 4V (A). Tot 15V (B.) Op de top breedte. Deze toename bij het versnellen van omstandigheden zorgt ervoor dat het strippen van restwater en buffer componenten, waardoor een zeer opgelost spectrum. De gemeten massa (60,240 ± 38 Da) komt overeen met een pentamere complex. C. de +15 laadtoestand toen werd geselecteerd voor tandem MS analyse (grijs gearceerd in het Configuratiescherm B.) D. De toename van de botsingsenergie zorgt ervoor dat de release van een hoog geladen monomeer, gecentreerd op 1664 m / z, en een gestript tetrameer complex, in het bereik van 5.000 - 8.000 m / z. Alle spectra werden verkregen uit een monster met 20 uM van de oplossing in 0,5 M ammoniumacetaat.

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complexes+in+the+gas+phase:+technology+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics.</a> Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).</li><li>Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+mass+spectrometry:+a+bridge+between+interactomics+and+structural+biology.">Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology.</a> Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).</li><li>Sharon, M., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+spectrometry+in+structure+elucidation+of+dynamic+protein+complexes.">The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).</li><li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry.">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).</li><li>Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+properties+of+the+nanoelectrospray+ion+source.">Analytical properties of the nanoelectrospray ion source.</a> Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).</li><li>Sobott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+mass+spectrometer+for+improved+transmission+and+analysis+of+large+macromolecular+assemblies.">A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies.</a> Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).</li><li>van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+a+quadrupole+time-of-flight+instrument+for+macromolecular+mass+spectrometry.">Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).</li><li>Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collisional+cooling+of+large+ions+in+electrospray+mass+spectrometry.">Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry.</a> Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).</li><li>Mora, d. e. l. a., J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+of+large+multiply+charged+species+proceeds+via+Dole+s+charged+residue+model.">Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model.</a> Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).</li><li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+macromolecular+tandem+mass+spectrometry+of+large+non-covalent+complexes+using+heavy+collision+gases.">Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases.</a> Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).</li><li>Benesch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometer+modified+for+higher-energy+dissociation+reduces+protein+assemblies+to+peptide+fragments.">Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments.</a> Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).</li><li>Taverner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+intact+protein+complexes+from+mass+spectrometry+and+homology+modeling.">Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling.</a> Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).</li><li>Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+MaxEnt+to+high+resolution+mass+spectrometry.">The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).</li><li>van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stoichiometries+and+oligomeric+states+of+glutamate+synthase+protein+complexes+with+curve+fitting+and+simulation+of+electrospray+mass+spectra.">Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+modularity+of+the+COP9+signalosome+complex+suggests+its+multifunctionality.">Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality.</a> Structure. 17 (1), 31-40 (2009).</li><li>Hernandez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+multimeric+complexes+isolated+directly+from+cells.">Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells.</a> EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).</li><li>Yadid, I., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+functional+beta-propeller+lectins+via+homo-oligomeric+assembly+of+shorter+fragments.">Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments.</a> J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).</li><li>Videler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+intact+ribosomes.">Mass spectrometry of intact ribosomes.</a> FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mass+spectrometry+of+viral+assemblies:+molecular+composition+and+stability+of+dimorphic+hepatitis+B+virus+capsids.">High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+shape+of+hepatitis+B+virus+capsids+in+vacuo.">Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).</li><li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry.">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=20S+proteasomes+have+the+potential+to+keep+substrates+in+store+for+continual+degradation.">20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).</li><li>van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates.">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring.">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li><li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes.">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid:+insights+from+MS+of+intact+complexes.">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li><li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3.">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li></ol>

Het verwerven van een hoge kwaliteit spectra aandacht moet worden besteed aan de monstervoorbereiding stappen, die sample concentratie en buffer uitwisseling omvatten. Meer dan verdunde monsters levert een laag signaal, terwijl de zeer geconcentreerde monsters kunnen worden nogal viskeus, en blokkeren de electrospray naald. Bovendien oplossing additieven zoals zouten, glycerol, detergenten, metaalionen, en reductiemiddelen (DTT of β-mercapto-ethanol), hebben de neiging zich te houden aan de buitenkant van de eiwitten, en de oorzaak verbreding van de pieken. Daarom, om goed opgelost toppen te bereiken, dient deze componenten worden toegevoegd aan de laagste concentraties mogelijk te maken. Een andere belangrijke parameter is de positie van de nanoflow capillaire, ten opzichte van de massa-spectrometer opening. Het vinden van de &quot;sweet spot&quot; zou een uitdaging zijn voor onervaren gebruikers, toch, dit in grote mate invloed op de kwaliteit van de spectra. Het is ook belangrijk om na te gaan van de nanoflow capillaire voorafgaand aan de start van de spray. De druppelgrootte is een functie van de tip diameter, die moet worden ~ 1 uM. Kleine druppeltjes leiden tot efficiëntere ionisatie, en zou daarom voordelig zijn. Het is ook belangrijk om te valideren dat er geen luchtbellen in de capillaire die de stroom kunnen blokkeren, en dat het goud coating is niet ontdaan van de capillaire tijdens de acquisitie, zo ja, verder trim de tip. Houd in gedachten dat een overmatige hoeveelheid monster zal de mogelijkheid van het optimaliseren van MS-voorwaarden, zoals de capillaire spanning, het versnellen van spanningen, druk, en botsing energie te verhogen. Over het geheel genomen zijn de procedures beschreven in het protocol is gebruikt om de samenstelling, de stoichiometrie en de architectuur van tal van eiwitcomplexen (zie reviews 2,3,4) te bepalen. Analyse van grote MDa complexen zoals het ribosoom 19 en sterk geordende virus capsiden 20-22, bij het ​​bepalen van substraat binding aan moleculaire machines 23-25, of de karakterisering van subunit interactienetwerken 26,17,16,17,27,28 dienen als maar een paar voorbeelden van de waarde van deze aanpak.

Voorbeeld eisen: <table border="1"><tr><td> Monster </td><td> Vereiste </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 1-2 pi </td><td> Per capillaire </td></tr><tr><td> Concentratie </td><td> 1-20μM </td><td> Per complex </td></tr><tr><td> Buffer </td><td> Aquanos vluchtige buffer zoals ammonium-acetaat bij pH = 6-8 </td><td> Typisch 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Wasmiddel </td><td> Minimaal </td><td> Clusters van wasmiddel moleculen produceren breed en pieken </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Minimaal is (tot 5%) </td><td> Hecht niet-specifiek aan eiwitten en daardoor zijn brede pieken waargenomen </td></tr><tr><td> Organische oplosmiddelen </td><td> Tot 50% </td><td> Zou denatureren eiwitten complexen </td></tr><tr><td> Zuren </td><td> Tot 4% </td><td> Denatureren eiwitcomplexen </td></tr><tr><td> Zouten </td><td> Minimaal </td><td> Zout adducten leiden tot een breed en pieken </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Minimaal </td><td> 1-2 uM kunnen aanwezig zijn </td></tr><tr><td> Chelaatvormers </td><td> Minimaal </td><td> Boven 250 uM leiden tot uitgebreide adductvorming </td></tr></table>

analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry

Levende cellen te controleren en reguleren van hun biologische processen door middel van de gecoördineerde actie van een groot aantal eiwitten die zichzelf assembleren tot een scala aan dynamische, multi-eiwitcomplexen 1. Te krijgen een mechanistisch begrip van de verschillende cellulaire processen, is het cruciaal om de structuur van een dergelijk eiwit-complexen te bepalen, en hoe hun structurele organisatie hun functie dicteert onthullen. Veel aspecten van multi-eiwit complexen zijn echter moeilijk te karakteriseren, door hun heterogene aard, asymmetrische structuur en dynamiek. Daarom zijn nieuwe benaderingen nodig zijn voor de studie van de tertiaire niveaus van proteïnen organisatie. Een van de opkomende structurele biologie tools voor het analyseren van macromoleculaire complexen is massaspectrometrie (MS) 2-5. Deze methode levert informatie over de complexe eiwitsamenstelling, subunit stoichiometrie, en structurele topologie. De kracht van MS is afgeleid van zijn hoge gevoeligheid en, als gevolg daarvan lage monster vereiste, dat het onderzoek van eiwitcomplexen uitgedrukt in endogene niveaus mogelijk maakt. Een ander voordeel is de snelheid van de analyse, die toezicht van reacties kunnen in real time. Bovendien kan de techniek gelijktijdig meten van de eigenschappen van afzonderlijke populaties naast elkaar bestaan ​​in een mengsel. We beschrijven hier een gedetailleerd protocol voor de toepassing van structurele MS om de analyse van grote verzamelingen van eiwitten. De procedure begint met de voorbereiding van de goud gecoate capillairen voor nanoflow electrospray ionisatie (Nesi). Het gaat dan met monstervoorbereiding, met nadruk op de buffer voorwaarden waaraan moet compatibel zijn met Nesi worden aan de ene kant, en in staat te stellen complexen intact aan de andere kant te houden. We dan uit te leggen, stap-voor-stap hoe u de experimentele condities te optimaliseren voor hoge massa-metingen en het verwerven van MS en tandem MS spectra. Ten slotte hebben we in kaart verwerking van gegevens en analyses die volgen. In plaats van te proberen om elk aspect van verzamelingen van eiwitten te karakteriseren, dit protocol bevat standaard MS-methoden, waardoor de prestaties van MS en MS / MS experimenten op niet-covalente complexen. Het geheel genomen, ons doel is om onderzoekers onbekend met het gebied van structurele MS, met kennis van de belangrijkste experimentele instrumenten.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

analyzing-large-protein-complexes-by-structural-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-wave Ion Mobility-massaspectrometrie: Basic Experimentele Procedures voor Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Atmosferische druk moleculaire beeldvorming van biologische weefsels en biofilms door LAESI massaspectrometrie

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Directe analyse van enkele cellen met behulp van massaspectrometrie bij atmosferische druk

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...