Name: analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00
Duration: 15 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Författarna tackar Sharon gruppmedlemmarna för deras kritiska granskning och för deras bidrag till manuskriptet. Vi är tacksamma för stödet från Morasha och Bikura program, Israel Science Foundation (Grant Nos 1823-1807 och 378/08), den Josef Cohn Minerva Centrum för Biomembrane forskning, Chais Familj Fellows program för nya forskare, Abraham och Sonia Rochlin Foundation, den Wolfson Family Charitable Trust, Helen och Milton A. Kimmelman Center för biomolekylär struktur och församlingen, dödsboet efter Shlomo och Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, och Karen Siem, Storbritannien. Vi är tacksamma till Dan Tawfik och Itamar Yadid för att ge oss lektin varianten provet.

Del 1: Förberedelser av guld-belagd kapillärer för nanoflow elektrospray jonisering Analys av icke-kovalenta komplex utförs vanligtvis med hjälp av nanoflow elektrospray jonisering (nESI) 6, med hjälp av glas eller kvarts kapillärerna som har dragit till en fin spets (~ 1 mm innerdiameter), och överdragna med ledande material (oftast guld) . Sådana kapillärer finns färdiga att använda från kommersiella källor (nya mål eller Proxeon), men kan det vara mer kostnadseffektivt att förbereda dem i egen regi: <ol><li> Stick två band av en dubbelsidig självhäftande dynan till botten av en petriskål, 2 cm mellanrum. Placera en glasstav (8 cm x 5 mm) i mitten av en av kuddar. Den självhäftande dynan håller kapillärerna på plats och glasstaven kommer att stödja den förberedda kapillärerna, och hålla tips från att bryta (Figur 1). </li><li> Använd borosilikatglas kapillärerna, 1,0 mm ytterdiameter x 0,78 mm id (vi använder på 500 tunn vägg borosilikat kapillärerna från Warner Instruments, katt. Nej. G100TF-4). Sätt en kapillär in nålen avdragare (vi använder modellen P-97 från Sutter Instrument Co). Spänn fast kapillär försiktigt på plats och justera dess position så att den ligger i mitten av nålen avdragare värme-glödtråd. Dra åt klämmorna försiktigt, tills kapillär hålls fast i båda ändar. </li><li> Dra kapillär, med hjälp av ett fördefinierat program. Varje kapillär drog ger upphov till två sista, formade kapillärer. Programplaneringen avdragaren är en av trial-and-error, tills en acceptabel spets form erhålls. Vi använder följande program: <table border="1"><tbody><tr><td> Steg </td><td> Hetta </td><td> Dra </td><td> Vell </td><td> Tid </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Ta bort drog kapillärerna från instrumentet och inspektera tips och kasta något som är deformerade eller trasiga. Använd trubbig pincett (vi använder positionering pincett från CK Precision), att placera kapillärerna i petriskål. Basen i kapillära skall bifogas den självhäftande dynan och den övre delen bör luta sig mot glasstaven, med spetsen pekande uppåt. </li><li> När petriskål är full (ca 80 kapillärer passa in i en 10 cm diameter fat), sätt in plattan i guld spotta bestrykare (vi använder modell nr. EMS550, från EMS). Se till att gastillförseln väljs enligt tillverkarens anvisningar, och aktivera en fördefinierad beläggning cykel (vi använder Argon tryck 4 psi, vid ett vakuum av 5 x 10 -2 mbar, en ström av 45mA, och en beläggning tid 1 min, för 3-6 cykler, tills kapillärerna är jämnt gyllene). </li></ol> Del 2: Provberedning <ol><li> Låg mikromolära koncentrationer av provet krävs (1 - 20 M). Om det behövs, koncentrera provet med centrifugal ultrafiltrering enheter (t.ex. Vivaspin från Sartorius, eller Nanosep från Pall Corporation). Det rekommenderas att du verifierar adsorption av det protein komplex till enheten membran, före användning. </li><li> Ofta rening buffertar eller lösningar förvaring av proteinkomplex är inte kompatibla med nESI, där endast flyktiga lösningar får användas. Därför är bufferten utbyta nödvändig. Denna kritiska steget, där alla spår av salter, molekyler buffert eller någon annan icke-flyktiga addukter såsom glycerol, DTT, eller EDTA tas bort, avgör kvaliteten på Spectra. Vanligtvis är vattenlösning ammoniumacetatlösning används, vid en koncentration på mellan 5 mm och 1 M, och vid 6-8 pH. Buffer utbyte kan utföras med en mikrocentrifug kolumn gelfiltrering (t.ex. Micro Bio-Spin 6 kromatografi kolonner från Bio-Rad). Detta steg kan upprepas 1-3 gånger med minimal utspädning (mindre än en faktor 1,3 per enhet 5), till maximalt utbyte uppnås. Om både koncentration och buffert utbyte krävs, kan dessa göras tillsammans, med hjälp av centrifugalkraften ultrafiltrering (e, g., Vivaspin från Sartorius, eller Nanosep från Pall Corporation). </li></ol> Del 3: Kalibrera masspektrometer för högmässan mätningar De flesta av de experiment som utförs på flera proteinkomplex utförs med en nano elektrospray quadrupol-time-of-flight (Q-TOF) instrument. Det rekommenderas att du använder en quadrupol massa filter justeras till låga frekvenser, för att möjliggöra överföring och massa analys av joner med hög m / z-värden 7,8. Det ärrekommenderas också att gas vikar 7,8 eller ärmar 9 läggas till instrumentet i första jon guiden, för att möjliggöra tryckreglering vid första vakuum scenen. Det senare möjliggör optimering av transmission och desolvation av mycket stora joner 7-9. För närvarande kommersiella ESI-TOF och Q-TOF-instrument finns tillgängliga från flera tillverkare (exempelvis Vatten, SCIEX, Bruker eller Agilent) som kan ändras relativt enkelt och kostnadseffektivt för native MS applikationer 7,8. Det är dock möjligt att använda standard SP eller QToF konfigurationer på instrument som LCT eller QToF1 (vatten) att förvärva masspektra för komplex upp till 1 MDA, utan behov av förändringar av hårdvaran 5. Det protokoll som beskrivs nedan har genomförts på ett Synapt instrument (vatten). <ol><li> Förbered 100 mg / ml lösning av CSI i renat vatten. CSI används för högmässa kalibrering som ensamma ut saltet kluster (CSI) n Cs + sträcker sig över ett brett massa olika, från 393 m / z till över 10.000 (Fig. 2). </li><li> Använda trubbig pincett, ta en belagd kapillär från petriskål och 2μL belastning av CSI lösningen i kapillär, med hjälp av en Eppendorf GeLoader spets. </li><li> Sätt kapillära i kapillär hållaren och justera kapillär på ett sådant sätt att toppen är ca 10 mm från kanten på hållaren. </li><li> Skjut lösningen mot spetsen av kapillär antingen manuellt eller med hjälp av en spinn ner adapter. </li><li> Placera kapillär i ett optiskt mikroskop och trimma spetsen, med hjälp av vassa AA-typ pincett. </li><li> Anslut kapillär hållaren till nanoflow ES-gränssnittet. Rotera xyz scenen bakåt för att undvika skador på kapillär och skjut scenen i sin aktiverat läge. Den kapillära bör placeras 1 - 10 mm från konen öppning. </li><li> Applicera kapillär spänning (1050-1400 V) och låg nanoflow tryck (0,00-0,03 bar) tills sprej initieras och försök att minska nanoflow trycket till ett mycket lågt värde. </li><li> Optimera signalen intensitet genom att justera placeringen av xyz scenen, kapillär spänning, nanoflow tryck, och desolvation gasflödet. </li><li> För att upptäcka en mängd massa olika CsI topp-serien, ska den accelererande spänning in optimalt (vi använder följande parametrar: kapillär 1,3-1,7 kV, prov cone 80-150V, extraktion kon 1-3 V). </li><li> För att optimera överföringen av hög massa joner, som kräver skonsam desolvation förhållanden, stöd trycket i den inledande vakuum etappen mellan källan och analysatorn, bör höjas. Detta kan uppnås genom att försiktigt minska värmeledningsförmåga källan vakuum linje till rulla pumpen, genom att delvis stänga avstängningsventil (SpeediValve). För att definiera den optimala punkten, bör dessa göras samtidigt övervaka effekten på signalen intensitet (vi brukar använda 3,0 till 6,5 mbar). </li><li> Samla ca 30 sökningar på en skanning / sek, på ett m / z-intervall på mellan 1000 till 15,000 m / z. </li><li> Efter förvärvet kalibrera TOF med lämplig kalibrering bordet. </li></ol> Del 4: MS-analys av intakt protein komplex <ol><li> Ladda ditt prov, enligt beskrivning (del 3, § § 2-5), och initiera spray. </li><li> Börja med första optimering av spray (del 3, § § 6-9), tills signalen upptäcks. Den exakta positionen av avgiften stater är protein-beroende, men det kan förutsägas med hjälp av relationen mellan jon massa och genomsnittliga avgiften tillstånd, alltså: (Z AV) 10: Z Av = 0,0778 √ (m), där m är massan av det komplexa i Daltons. För att förhindra komplexa dissociation, inte värmen inte jonkälla: antingen stänga av värmaren, eller hålla temperaturen under 40 ° C. </li><li> Variera kapillär position prov kon och extraktorer spänning för att maximera jon överföring, och kontrollera den resulterande förändringen i spektrat. En möjlig utgångspunkt skulle kunna vara kon spänning 100 V, fläkten cone: 1 V; kapillär spänning 1,5 kV. Optimera dessa parametrar, i kombination med nanoflow tryck. </li><li> För att förbättra desolvation och band av avloppsvatten och komponenter buffert, öka bias spänning och gastrycket i kollisionen cellen. Detta steg ska utföras noggrant för att förhindra dissociation av komplexet. Typiska fördomar spänningar inom intervallet 1-10 V, med en fälla gasflöde på 1-10 ml / min (Fig. 3). Manuell justering av RF-inställning och quadrupol profil kan förbättra överföringen av högmässa joner. </li><li> Justera Trap och Överför energier kollision. Ofta är högre spänningar krävs för överföring av hög massa joner (vanligtvis inom intervallet 10-30 V). I detta läge är det viktigt att undvika kollision-inducerad dissociation av komplexet. </li><li> Efter en stabil signal reached rekommenderas att nanoflow trycket och kapillär spänning sänkas till minimala värden, samtidigt stabil spray. </li></ol> Del 5: Tandem-masspektrometri: isär proteinkomplex <ol><li> När en optimal och stabil signal har erhållits genom att välja en föregångare jon. Ställ massan centrum och isolering bredd (vi använder i allmänhet en LM upplösning på 12 och en HM upplösning på mellan 13 och 15). Använd en bred massa olika att upptäcka högmässa / låg kostnad dissociation produkter. Det rekommenderas att du ställer in m / z intervall till den högsta nivån, och sedan reducera det till önskade värden. Vi ytterligare föreslår överlagras av MS och MS / MS spektra, att validera isolering av den valda föregångare jon. </li><li> För att utföra MS / MS, särskilja föregångaren jon genom att öka kollision energi (CE) och trycket på kollisionen cellen. Öka antingen fälla eller Överför CE gradvis, i steg om 10-20V, och höja trycket kollision gas till 0-5 ml / min (gemensamma värderingar). Övervaka förändringar i spektrat tills optimalt aktivering betingelser uppnåtts. Hög aktiveringsenergi kan inducera dissociation av en eller flera subenheter från intakt komplex, och klargöra samspelet tillhörighet av olika subenheter. Vi använder vanligtvis Argon som en kollision gas i fällan / Transfer celler, även om fördelarna med att använda en tyngre gas (t.ex., Xe eller SF 6) har rapporterats, men dessa gaser är betydligt dyrare 11 (Fig. 3). </li><li> Det rekommenderas att mer än en laddningstillstånd väljas för MS / MS analys. Vid överlappande komponenter, kommer att förvärva en uppsättning av tandem MS spektra bidra till att lösa avgiften serien av olika populationer. Dessutom kommer högre avgift stater avstånd lättare, jämfört med lägre kostnad stater 12. </li><li> Utöver den karakterisering av intakt komplex, föreslås det att mindre subcomplexes i lösningen kommer att genereras under milda denaturering villkor. MS och MS / MS analyser av subcomplexes utgör grunden för att definiera subenheten arkitektur komplex 13. För partiellt avbrott i subenheten-subenheten interaktioner, gradvis lägga organiska lösningsmedel (t.ex. metanol, isopropanol, eller acetonitril) upp till en koncentration av 50% eller ändra pH i lösningen genom att tillsätta ammoniak eller myrsyra (upp till en koncentration av 4 %). </li><li> För att bestämma massan av de enskilda subenheter som utgör den komplexa är det viktigt att skaffa sig ett spektrum i denaturering villkor. Detta kan utföras med Zip-Tip C 4 (Millipore) med en 25:75 vatten / acetonitril tal, med 1% myrsyra som elueringslösningen. </li></ol> Del 6: Databehandling och analys <ol><li> Data analyseras nu, med hjälp av en spektralanalys program för MS spektra. Vi använder normalt MassLynx programmet (vatten). </li><li> För spektra som spänner över ett brett m / z-intervall, rekommenderar vi att olika system för utjämning och centroiden parametrar tillämpas för höga och låga m / z-regioner, för att spegla skillnaden i topp lösa dessa regioner. </li><li> Att identifiera ladda serie och beräkna kostnad stater och massorna, den &quot;manuella hitta&quot; funktion MassLynx kan tillämpas. I fall av komplexa masspektra med överlappande komponenter, kan manuell beräkning av massorna vara enklare. </li><li> För att underlätta dessa uppdrag processer kan ytterligare programvara användas, till exempel: MaxEnt för spektra deconvolution 14 SOMMS för bästa passform och simulering 15, och SUMMIT för tilldelning sammansättning och stökiometri av protein subcomplexes och skapa nätverk proteininteraktioner 13,16,17 . </li></ol> Del 7: representativa resultat <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Förbereda guld-belagd nano-elektrospray kapillärer. A. Fäst två dubbelhäftande tejp till en petriskål, 2 cm mellanrum. För att stödja den förberedda kapillärerna, placera en glasstav (8 cm x 5 mm) i mitten av en av elektroderna. B. Stick den trubbiga änden av beredd kapillärerna att den självhäftande dynan, och luta spetsen på glasstav. C. När petriskålen är fylld med det färdiga kapillärerna, päls dem med guld till en tunn film av guld är jämnt deponeras på den yttre ytan på kapillärerna. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Högmässa kalibrering med hjälp av cesium jodid joner. Den stora och monisotopic kluster av CSI har gjort det sammansatta i valet för kalibrering av masspektrometrar för högmässa analys. Serien av jämnt fördelade toppar sträcker sig över ett brett spektrum, från m / z 393 till över 10.000. De är assigNed till enstaka laddade salt kluster av den allmänna sammansättningen (CSI) n Cs +. Ytterligare signaler mellan de stora topparna orsakas av dubbel-och triple-laddade arter av serien, [(CSI) n CS2] 2 + och [(CSI) n Cs3] 3 +, respektive. Öka trycket i den inledande vakuum arenan är avgörande för att upptäcka högmässa kluster. Effekten av tryck på högmässa toppar visas i paneler A. och B. med tryck readbacks på 1,2 och 5,3, respektive. C. Expansion av masspektrum visas på B. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Nanoflow elektrospray masspektra en pentameric lektin. A. masspektrometri av en lektin variant komplex (från Lib1-B7 genom riktad evolution 18) ger upphov till en distributioner laddningstillstånd mellan 3.000 och 5.000 m / z, men på grund av otillräcklig desolvation av joner, topparna är breda. Jämförelse av panel A. och B. visar effekten av ökad partiskhet spänningen från 4V (A.) Till 15V (B.) På toppens bredd. Denna ökning av accelererande förhållanden gör att strippa av kvarvarande vatten och komponenter buffert, vilket ger en mycket löst spektrum. Den uppmätta massan (60.240 ± 38 Da) motsvarar en pentameric komplex. C. 15 laddningstillstånd sedan valdes ut för tandem MS-analys (skuggade i grått i Panel B.) D. Ökningen i kollision energi orsakar frisättning av en laddad monomer, centrerad på 1664 m / z och en strippad tetrameriskt komplex, i intervallet 5000 - 8000 m / z. Alla spektra erhölls från ett prov som innehåller 20 mikroM lösning i 0,5 M ammoniumacetat.

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complexes+in+the+gas+phase:+technology+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics.</a> Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).</li><li>Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+mass+spectrometry:+a+bridge+between+interactomics+and+structural+biology.">Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology.</a> Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).</li><li>Sharon, M., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+spectrometry+in+structure+elucidation+of+dynamic+protein+complexes.">The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).</li><li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry.">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).</li><li>Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+properties+of+the+nanoelectrospray+ion+source.">Analytical properties of the nanoelectrospray ion source.</a> Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).</li><li>Sobott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+mass+spectrometer+for+improved+transmission+and+analysis+of+large+macromolecular+assemblies.">A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies.</a> Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).</li><li>van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+a+quadrupole+time-of-flight+instrument+for+macromolecular+mass+spectrometry.">Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).</li><li>Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collisional+cooling+of+large+ions+in+electrospray+mass+spectrometry.">Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry.</a> Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).</li><li>Mora, d. e. l. a., J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+of+large+multiply+charged+species+proceeds+via+Dole+s+charged+residue+model.">Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model.</a> Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).</li><li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+macromolecular+tandem+mass+spectrometry+of+large+non-covalent+complexes+using+heavy+collision+gases.">Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases.</a> Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).</li><li>Benesch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometer+modified+for+higher-energy+dissociation+reduces+protein+assemblies+to+peptide+fragments.">Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments.</a> Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).</li><li>Taverner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+intact+protein+complexes+from+mass+spectrometry+and+homology+modeling.">Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling.</a> Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).</li><li>Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+MaxEnt+to+high+resolution+mass+spectrometry.">The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).</li><li>van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stoichiometries+and+oligomeric+states+of+glutamate+synthase+protein+complexes+with+curve+fitting+and+simulation+of+electrospray+mass+spectra.">Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+modularity+of+the+COP9+signalosome+complex+suggests+its+multifunctionality.">Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality.</a> Structure. 17 (1), 31-40 (2009).</li><li>Hernandez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+multimeric+complexes+isolated+directly+from+cells.">Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells.</a> EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).</li><li>Yadid, I., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+functional+beta-propeller+lectins+via+homo-oligomeric+assembly+of+shorter+fragments.">Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments.</a> J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).</li><li>Videler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+intact+ribosomes.">Mass spectrometry of intact ribosomes.</a> FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mass+spectrometry+of+viral+assemblies:+molecular+composition+and+stability+of+dimorphic+hepatitis+B+virus+capsids.">High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+shape+of+hepatitis+B+virus+capsids+in+vacuo.">Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).</li><li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry.">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=20S+proteasomes+have+the+potential+to+keep+substrates+in+store+for+continual+degradation.">20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).</li><li>van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates.">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring.">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li><li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes.">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid:+insights+from+MS+of+intact+complexes.">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li><li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3.">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li></ol>

För att få hög kvalitet spektra uppmärksamhet bör ägnas åt steg provberedning, som omfattar prov koncentration och buffert utbyte. Under spädda prover kommer att ge en låg signal, medan starkt koncentrerade prover kan vara ganska trögflytande, och blockera elektrospray nålen. Dessutom lösning tillsatser som salter, glycerol, tvättmedel, metalljoner och reduktionsmedel (DTT eller β-merkaptoetanol), tenderar att ansluta sig till den yttre ytan av proteiner, och orsakar breddning av topparna. Därför, i syfte att uppnå väl löst toppar, bör dessa komponenter läggas till lägsta koncentrationer som möjligt. En annan viktig parameter är placeringen av nanoflow kapillär, i förhållande till masspektrometer öppning. Att hitta den &quot;sweet spot&quot; kan vara en utmaning för oerfarna användare, men trots det betydligt påverkar kvaliteten på Spectra. Det är också viktigt att undersöka nanoflow kapillär före initiering av spray. Droppstorleken är en funktion av spetsen diameter, som bör vara ~ 1μm. Små droppar leder till effektivare jonisering, och skulle därför vara fördelaktigt. Det är också viktigt att kontrollera att det inte finns några luftbubblor i kapillär som kan blockera flödet, och att guldet beläggningen inte är strippad från kapillär vid förvärvet och i så fall ytterligare trimma spetsen. Tänk på att en överdriven mängd av provet kommer att öka möjligheten att optimera MS villkor såsom kapillär spänning, accelererande spänning, tryck, och kollision energi. Sammantaget har de förfaranden som beskrivs i det protokoll som använts för att bestämma sammansättningen, stökiometri och arkitektur av många proteinkomplex (se recensioner 2,3,4). Analys av stora MDA komplex som ribosomer 19 och mycket beställde capsids virus 20-22, vid fastställandet av substrat bindning till molekylära maskiner 23-25, eller karakterisering av nätverk subenheten interaktion 26,17,16,17,27,28 fungera som men några exempel på värdet av denna strategi.

Exempel på krav: <table border="1"><tr><td> Exempel på </td><td> Krav </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Volym </td><td> 1-2 mikroliter </td><td> Per kapillär </td></tr><tr><td> Koncentration </td><td> 1-20 mikroM </td><td> Per komplexa </td></tr><tr><td> Buffer </td><td> Aquanos flyktiga buffert som ammoniumacetat vid pH = 6 till 8 </td><td> Normalt 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Tvättmedel </td><td> Minimal </td><td> Kluster av tvättmedel molekyler producera bred och olösta toppar </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Minimal (upp till 5%) </td><td> Fäster ospecifikt till proteiner och därmed breda toppar observeras </td></tr><tr><td> Organiska lösningsmedel </td><td> Upp till 50% </td><td> Kan denaturera proteiner komplex </td></tr><tr><td> Syror </td><td> Upp till 4% </td><td> Denaturera proteinkomplex </td></tr><tr><td> Salter </td><td> Minimal </td><td> Salt addukter leda till en bred och olösta toppar </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Minimal </td><td> 1-2 mikroM kan finnas </td></tr><tr><td> Kelatbildare </td><td> Minimal </td><td> Över 250 mikroM leda till omfattande addukt bildning </td></tr></table>

analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry

Levande celler kontrollera och reglera deras biologiska processer genom samordnade insatser av ett stort antal proteiner som ihop sig i en rad dynamiska, multi-protein komplex 1. För att få en mekanistisk förståelse av de olika cellulära processer är det viktigt att bestämma strukturen av sådana proteinkomplex, och avslöja hur deras organisationsstruktur dikterar deras funktion. Många aspekter av multi-protein komplex är dock svårt att karakterisera på grund av sin heterogena natur, asymmetrisk struktur och dynamik. Därför är nya metoder krävs för att studera den tertiära nivåerna av protein organisation. En av de framväxande strukturbiologi verktyg för att analysera makromolekylära komplex är masspektrometri (MS) 2-5. Denna metod ger information om de komplexa protein sammansättning, subenhet stökiometri, och strukturella topologi. Kraften i MS följd av dess höga känslighet och, som en följd av låga prov krav, som möjliggör granskning av proteinkomplex som framfördes vid endogena nivåer. En annan fördel är hastigheten av analys, som möjliggör övervakning av reaktioner i realtid. Dessutom kan tekniken mäta samtidigt egenskaper hos olika populationer samexisterande i en blandning. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för tillämpning av strukturella MS för analys av stora protein församlingar. Proceduren börjar med förberedelserna av guld-belagd kapillärer för nanoflow elektrospray jonisation (nESI). Det fortsätter sedan med provberedning, med betoning på bufferten villkor som bör vara förenligt med nESI å ena sidan, och gör det möjligt att upprätthålla komplex intakta på den andra. Vi förklarar då steg för steg hur man kan optimera de experimentella förutsättningar för hög massa mätningar och skaffa MS och tandem MS spektra. Slutligen kartlägger vi databearbetning och analyser som följer. Hellre än att försöka beskriva varje aspekt av protein församlingar, införs i detta protokoll grundläggande MS-förfaranden, vilket gör att resultatet för MS och MS / MS experiment med icke-kovalenta komplex. Sammantaget är vårt mål att ge forskare obekant med området strukturella MS, med kunskap om de viktigaste experimentella verktyg.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Masspektrometri har visat sig vara ett värdefullt verktyg för analys av stora proteinkomplex. Denna metod ger insikter om sammansättning, stökiometri och övergripande arkitektur av multi-subenhet församlingar. Här beskriver vi, steg för steg, hur du utför en strukturell analys masspektrometri, och karakterisera makromolekylära strukturer.

Analysera stora proteinkomplex från struktur-masspektrometri

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

analyzing-large-protein-complexes-by-structural-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-vågen Ion Mobility-masspektrometri: Grundläggande experimentell Rutiner för Protein Komplex analys

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Atmosfäriskt tryck Molecular Imaging av biologisk vävnad och Biofilmer av LAESI masspektrometri

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Direkt analys av enskilda celler med masspektrometri vid atmosfärstryck

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Profilering Tiol Redox Proteome Användning Isotope spektrometri Taggning Mäss

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Ett protokoll för identifiering av protein-proteininteraktioner Baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk märkning, immunoutfällning, kvantitativa masspektrometri och Affinity modulering

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-fri Metod för bindningsaffinitet Bestämning genom Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

En ny metod för jämförande analys av multiproteinkomplex baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolic Märkning och kvantitativ masspektrometri

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Vald Reaction Monitoring masspektrometri för Absolute protein kvantifiering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...