Name: analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00
Duration: 15 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Författarna tackar Sharon gruppmedlemmarna för deras kritiska granskning och för deras bidrag till manuskriptet. Vi är tacksamma för stödet från Morasha och Bikura program, Israel Science Foundation (Grant Nos 1823-1807 och 378/08), den Josef Cohn Minerva Centrum för Biomembrane forskning, Chais Familj Fellows program för nya forskare, Abraham och Sonia Rochlin Foundation, den Wolfson Family Charitable Trust, Helen och Milton A. Kimmelman Center för biomolekylär struktur och församlingen, dödsboet efter Shlomo och Sabine Beirzwinsky; Meil ​​de Botton Aynsley, och Karen Siem, Storbritannien. Vi är tacksamma till Dan Tawfik och Itamar Yadid för att ge oss lektin varianten provet.

Del 1: Förberedelser av guld-belagd kapillärer för nanoflow elektrospray jonisering Analys av icke-kovalenta komplex utförs vanligtvis med hjälp av nanoflow elektrospray jonisering (nESI) 6, med hjälp av glas eller kvarts kapillärerna som har dragit till en fin spets (~ 1 mm innerdiameter), och överdragna med ledande material (oftast guld) . Sådana kapillärer finns färdiga att använda från kommersiella källor (nya mål eller Proxeon), men kan det vara mer kostnadseffektivt att förbereda dem i egen regi: <ol><li> Stick två band av en dubbelsidig självhäftande dynan till botten av en petriskål, 2 cm mellanrum. Placera en glasstav (8 cm x 5 mm) i mitten av en av kuddar. Den självhäftande dynan håller kapillärerna på plats och glasstaven kommer att stödja den förberedda kapillärerna, och hålla tips från att bryta (Figur 1). </li><li> Använd borosilikatglas kapillärerna, 1,0 mm ytterdiameter x 0,78 mm id (vi använder på 500 tunn vägg borosilikat kapillärerna från Warner Instruments, katt. Nej. G100TF-4). Sätt en kapillär in nålen avdragare (vi använder modellen P-97 från Sutter Instrument Co). Spänn fast kapillär försiktigt på plats och justera dess position så att den ligger i mitten av nålen avdragare värme-glödtråd. Dra åt klämmorna försiktigt, tills kapillär hålls fast i båda ändar. </li><li> Dra kapillär, med hjälp av ett fördefinierat program. Varje kapillär drog ger upphov till två sista, formade kapillärer. Programplaneringen avdragaren är en av trial-and-error, tills en acceptabel spets form erhålls. Vi använder följande program: <table border="1"><tbody><tr><td> Steg </td><td> Hetta </td><td> Dra </td><td> Vell </td><td> Tid </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Ta bort drog kapillärerna från instrumentet och inspektera tips och kasta något som är deformerade eller trasiga. Använd trubbig pincett (vi använder positionering pincett från CK Precision), att placera kapillärerna i petriskål. Basen i kapillära skall bifogas den självhäftande dynan och den övre delen bör luta sig mot glasstaven, med spetsen pekande uppåt. </li><li> När petriskål är full (ca 80 kapillärer passa in i en 10 cm diameter fat), sätt in plattan i guld spotta bestrykare (vi använder modell nr. EMS550, från EMS). Se till att gastillförseln väljs enligt tillverkarens anvisningar, och aktivera en fördefinierad beläggning cykel (vi använder Argon tryck 4 psi, vid ett vakuum av 5 x 10 -2 mbar, en ström av 45mA, och en beläggning tid 1 min, för 3-6 cykler, tills kapillärerna är jämnt gyllene). </li></ol> Del 2: Provberedning <ol><li> Låg mikromolära koncentrationer av provet krävs (1 - 20 M). Om det behövs, koncentrera provet med centrifugal ultrafiltrering enheter (t.ex. Vivaspin från Sartorius, eller Nanosep från Pall Corporation). Det rekommenderas att du verifierar adsorption av det protein komplex till enheten membran, före användning. </li><li> Ofta rening buffertar eller lösningar förvaring av proteinkomplex är inte kompatibla med nESI, där endast flyktiga lösningar får användas. Därför är bufferten utbyta nödvändig. Denna kritiska steget, där alla spår av salter, molekyler buffert eller någon annan icke-flyktiga addukter såsom glycerol, DTT, eller EDTA tas bort, avgör kvaliteten på Spectra. Vanligtvis är vattenlösning ammoniumacetatlösning används, vid en koncentration på mellan 5 mm och 1 M, och vid 6-8 pH. Buffer utbyte kan utföras med en mikrocentrifug kolumn gelfiltrering (t.ex. Micro Bio-Spin 6 kromatografi kolonner från Bio-Rad). Detta steg kan upprepas 1-3 gånger med minimal utspädning (mindre än en faktor 1,3 per enhet 5), till maximalt utbyte uppnås. Om både koncentration och buffert utbyte krävs, kan dessa göras tillsammans, med hjälp av centrifugalkraften ultrafiltrering (e, g., Vivaspin från Sartorius, eller Nanosep från Pall Corporation). </li></ol> Del 3: Kalibrera masspektrometer för högmässan mätningar De flesta av de experiment som utförs på flera proteinkomplex utförs med en nano elektrospray quadrupol-time-of-flight (Q-TOF) instrument. Det rekommenderas att du använder en quadrupol massa filter justeras till låga frekvenser, för att möjliggöra överföring och massa analys av joner med hög m / z-värden 7,8. Det ärrekommenderas också att gas vikar 7,8 eller ärmar 9 läggas till instrumentet i första jon guiden, för att möjliggöra tryckreglering vid första vakuum scenen. Det senare möjliggör optimering av transmission och desolvation av mycket stora joner 7-9. För närvarande kommersiella ESI-TOF och Q-TOF-instrument finns tillgängliga från flera tillverkare (exempelvis Vatten, SCIEX, Bruker eller Agilent) som kan ändras relativt enkelt och kostnadseffektivt för native MS applikationer 7,8. Det är dock möjligt att använda standard SP eller QToF konfigurationer på instrument som LCT eller QToF1 (vatten) att förvärva masspektra för komplex upp till 1 MDA, utan behov av förändringar av hårdvaran 5. Det protokoll som beskrivs nedan har genomförts på ett Synapt instrument (vatten). <ol><li> Förbered 100 mg / ml lösning av CSI i renat vatten. CSI används för högmässa kalibrering som ensamma ut saltet kluster (CSI) n Cs + sträcker sig över ett brett massa olika, från 393 m / z till över 10.000 (Fig. 2). </li><li> Använda trubbig pincett, ta en belagd kapillär från petriskål och 2μL belastning av CSI lösningen i kapillär, med hjälp av en Eppendorf GeLoader spets. </li><li> Sätt kapillära i kapillär hållaren och justera kapillär på ett sådant sätt att toppen är ca 10 mm från kanten på hållaren. </li><li> Skjut lösningen mot spetsen av kapillär antingen manuellt eller med hjälp av en spinn ner adapter. </li><li> Placera kapillär i ett optiskt mikroskop och trimma spetsen, med hjälp av vassa AA-typ pincett. </li><li> Anslut kapillär hållaren till nanoflow ES-gränssnittet. Rotera xyz scenen bakåt för att undvika skador på kapillär och skjut scenen i sin aktiverat läge. Den kapillära bör placeras 1 - 10 mm från konen öppning. </li><li> Applicera kapillär spänning (1050-1400 V) och låg nanoflow tryck (0,00-0,03 bar) tills sprej initieras och försök att minska nanoflow trycket till ett mycket lågt värde. </li><li> Optimera signalen intensitet genom att justera placeringen av xyz scenen, kapillär spänning, nanoflow tryck, och desolvation gasflödet. </li><li> För att upptäcka en mängd massa olika CsI topp-serien, ska den accelererande spänning in optimalt (vi använder följande parametrar: kapillär 1,3-1,7 kV, prov cone 80-150V, extraktion kon 1-3 V). </li><li> För att optimera överföringen av hög massa joner, som kräver skonsam desolvation förhållanden, stöd trycket i den inledande vakuum etappen mellan källan och analysatorn, bör höjas. Detta kan uppnås genom att försiktigt minska värmeledningsförmåga källan vakuum linje till rulla pumpen, genom att delvis stänga avstängningsventil (SpeediValve). För att definiera den optimala punkten, bör dessa göras samtidigt övervaka effekten på signalen intensitet (vi brukar använda 3,0 till 6,5 mbar). </li><li> Samla ca 30 sökningar på en skanning / sek, på ett m / z-intervall på mellan 1000 till 15,000 m / z. </li><li> Efter förvärvet kalibrera TOF med lämplig kalibrering bordet. </li></ol> Del 4: MS-analys av intakt protein komplex <ol><li> Ladda ditt prov, enligt beskrivning (del 3, § § 2-5), och initiera spray. </li><li> Börja med första optimering av spray (del 3, § § 6-9), tills signalen upptäcks. Den exakta positionen av avgiften stater är protein-beroende, men det kan förutsägas med hjälp av relationen mellan jon massa och genomsnittliga avgiften tillstånd, alltså: (Z AV) 10: Z Av = 0,0778 √ (m), där m är massan av det komplexa i Daltons. För att förhindra komplexa dissociation, inte värmen inte jonkälla: antingen stänga av värmaren, eller hålla temperaturen under 40 ° C. </li><li> Variera kapillär position prov kon och extraktorer spänning för att maximera jon överföring, och kontrollera den resulterande förändringen i spektrat. En möjlig utgångspunkt skulle kunna vara kon spänning 100 V, fläkten cone: 1 V; kapillär spänning 1,5 kV. Optimera dessa parametrar, i kombination med nanoflow tryck. </li><li> För att förbättra desolvation och band av avloppsvatten och komponenter buffert, öka bias spänning och gastrycket i kollisionen cellen. Detta steg ska utföras noggrant för att förhindra dissociation av komplexet. Typiska fördomar spänningar inom intervallet 1-10 V, med en fälla gasflöde på 1-10 ml / min (Fig. 3). Manuell justering av RF-inställning och quadrupol profil kan förbättra överföringen av högmässa joner. </li><li> Justera Trap och Överför energier kollision. Ofta är högre spänningar krävs för överföring av hög massa joner (vanligtvis inom intervallet 10-30 V). I detta läge är det viktigt att undvika kollision-inducerad dissociation av komplexet. </li><li> Efter en stabil signal reached rekommenderas att nanoflow trycket och kapillär spänning sänkas till minimala värden, samtidigt stabil spray. </li></ol> Del 5: Tandem-masspektrometri: isär proteinkomplex <ol><li> När en optimal och stabil signal har erhållits genom att välja en föregångare jon. Ställ massan centrum och isolering bredd (vi använder i allmänhet en LM upplösning på 12 och en HM upplösning på mellan 13 och 15). Använd en bred massa olika att upptäcka högmässa / låg kostnad dissociation produkter. Det rekommenderas att du ställer in m / z intervall till den högsta nivån, och sedan reducera det till önskade värden. Vi ytterligare föreslår överlagras av MS och MS / MS spektra, att validera isolering av den valda föregångare jon. </li><li> För att utföra MS / MS, särskilja föregångaren jon genom att öka kollision energi (CE) och trycket på kollisionen cellen. Öka antingen fälla eller Överför CE gradvis, i steg om 10-20V, och höja trycket kollision gas till 0-5 ml / min (gemensamma värderingar). Övervaka förändringar i spektrat tills optimalt aktivering betingelser uppnåtts. Hög aktiveringsenergi kan inducera dissociation av en eller flera subenheter från intakt komplex, och klargöra samspelet tillhörighet av olika subenheter. Vi använder vanligtvis Argon som en kollision gas i fällan / Transfer celler, även om fördelarna med att använda en tyngre gas (t.ex., Xe eller SF 6) har rapporterats, men dessa gaser är betydligt dyrare 11 (Fig. 3). </li><li> Det rekommenderas att mer än en laddningstillstånd väljas för MS / MS analys. Vid överlappande komponenter, kommer att förvärva en uppsättning av tandem MS spektra bidra till att lösa avgiften serien av olika populationer. Dessutom kommer högre avgift stater avstånd lättare, jämfört med lägre kostnad stater 12. </li><li> Utöver den karakterisering av intakt komplex, föreslås det att mindre subcomplexes i lösningen kommer att genereras under milda denaturering villkor. MS och MS / MS analyser av subcomplexes utgör grunden för att definiera subenheten arkitektur komplex 13. För partiellt avbrott i subenheten-subenheten interaktioner, gradvis lägga organiska lösningsmedel (t.ex. metanol, isopropanol, eller acetonitril) upp till en koncentration av 50% eller ändra pH i lösningen genom att tillsätta ammoniak eller myrsyra (upp till en koncentration av 4 %). </li><li> För att bestämma massan av de enskilda subenheter som utgör den komplexa är det viktigt att skaffa sig ett spektrum i denaturering villkor. Detta kan utföras med Zip-Tip C 4 (Millipore) med en 25:75 vatten / acetonitril tal, med 1% myrsyra som elueringslösningen. </li></ol> Del 6: Databehandling och analys <ol><li> Data analyseras nu, med hjälp av en spektralanalys program för MS spektra. Vi använder normalt MassLynx programmet (vatten). </li><li> För spektra som spänner över ett brett m / z-intervall, rekommenderar vi att olika system för utjämning och centroiden parametrar tillämpas för höga och låga m / z-regioner, för att spegla skillnaden i topp lösa dessa regioner. </li><li> Att identifiera ladda serie och beräkna kostnad stater och massorna, den &quot;manuella hitta&quot; funktion MassLynx kan tillämpas. I fall av komplexa masspektra med överlappande komponenter, kan manuell beräkning av massorna vara enklare. </li><li> För att underlätta dessa uppdrag processer kan ytterligare programvara användas, till exempel: MaxEnt för spektra deconvolution 14 SOMMS för bästa passform och simulering 15, och SUMMIT för tilldelning sammansättning och stökiometri av protein subcomplexes och skapa nätverk proteininteraktioner 13,16,17 . </li></ol> Del 7: representativa resultat <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Förbereda guld-belagd nano-elektrospray kapillärer. A. Fäst två dubbelhäftande tejp till en petriskål, 2 cm mellanrum. För att stödja den förberedda kapillärerna, placera en glasstav (8 cm x 5 mm) i mitten av en av elektroderna. B. Stick den trubbiga änden av beredd kapillärerna att den självhäftande dynan, och luta spetsen på glasstav. C. När petriskålen är fylld med det färdiga kapillärerna, päls dem med guld till en tunn film av guld är jämnt deponeras på den yttre ytan på kapillärerna. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Högmässa kalibrering med hjälp av cesium jodid joner. Den stora och monisotopic kluster av CSI har gjort det sammansatta i valet för kalibrering av masspektrometrar för högmässa analys. Serien av jämnt fördelade toppar sträcker sig över ett brett spektrum, från m / z 393 till över 10.000. De är assigNed till enstaka laddade salt kluster av den allmänna sammansättningen (CSI) n Cs +. Ytterligare signaler mellan de stora topparna orsakas av dubbel-och triple-laddade arter av serien, [(CSI) n CS2] 2 + och [(CSI) n Cs3] 3 +, respektive. Öka trycket i den inledande vakuum arenan är avgörande för att upptäcka högmässa kluster. Effekten av tryck på högmässa toppar visas i paneler A. och B. med tryck readbacks på 1,2 och 5,3, respektive. C. Expansion av masspektrum visas på B. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Nanoflow elektrospray masspektra en pentameric lektin. A. masspektrometri av en lektin variant komplex (från Lib1-B7 genom riktad evolution 18) ger upphov till en distributioner laddningstillstånd mellan 3.000 och 5.000 m / z, men på grund av otillräcklig desolvation av joner, topparna är breda. Jämförelse av panel A. och B. visar effekten av ökad partiskhet spänningen från 4V (A.) Till 15V (B.) På toppens bredd. Denna ökning av accelererande förhållanden gör att strippa av kvarvarande vatten och komponenter buffert, vilket ger en mycket löst spektrum. Den uppmätta massan (60.240 ± 38 Da) motsvarar en pentameric komplex. C. 15 laddningstillstånd sedan valdes ut för tandem MS-analys (skuggade i grått i Panel B.) D. Ökningen i kollision energi orsakar frisättning av en laddad monomer, centrerad på 1664 m / z och en strippad tetrameriskt komplex, i intervallet 5000 - 8000 m / z. Alla spektra erhölls från ett prov som innehåller 20 mikroM lösning i 0,5 M ammoniumacetat.

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complexes+in+the+gas+phase:+technology+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics.</a> Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).</li><li>Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+mass+spectrometry:+a+bridge+between+interactomics+and+structural+biology.">Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology.</a> Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).</li><li>Sharon, M., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+spectrometry+in+structure+elucidation+of+dynamic+protein+complexes.">The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).</li><li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry.">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).</li><li>Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+properties+of+the+nanoelectrospray+ion+source.">Analytical properties of the nanoelectrospray ion source.</a> Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).</li><li>Sobott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+mass+spectrometer+for+improved+transmission+and+analysis+of+large+macromolecular+assemblies.">A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies.</a> Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).</li><li>van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+a+quadrupole+time-of-flight+instrument+for+macromolecular+mass+spectrometry.">Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).</li><li>Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collisional+cooling+of+large+ions+in+electrospray+mass+spectrometry.">Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry.</a> Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).</li><li>Mora, d. e. l. a., J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+of+large+multiply+charged+species+proceeds+via+Dole+s+charged+residue+model.">Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model.</a> Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).</li><li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+macromolecular+tandem+mass+spectrometry+of+large+non-covalent+complexes+using+heavy+collision+gases.">Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases.</a> Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).</li><li>Benesch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometer+modified+for+higher-energy+dissociation+reduces+protein+assemblies+to+peptide+fragments.">Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments.</a> Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).</li><li>Taverner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+intact+protein+complexes+from+mass+spectrometry+and+homology+modeling.">Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling.</a> Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).</li><li>Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+MaxEnt+to+high+resolution+mass+spectrometry.">The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).</li><li>van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stoichiometries+and+oligomeric+states+of+glutamate+synthase+protein+complexes+with+curve+fitting+and+simulation+of+electrospray+mass+spectra.">Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+modularity+of+the+COP9+signalosome+complex+suggests+its+multifunctionality.">Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality.</a> Structure. 17 (1), 31-40 (2009).</li><li>Hernandez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+multimeric+complexes+isolated+directly+from+cells.">Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells.</a> EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).</li><li>Yadid, I., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+functional+beta-propeller+lectins+via+homo-oligomeric+assembly+of+shorter+fragments.">Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments.</a> J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).</li><li>Videler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+intact+ribosomes.">Mass spectrometry of intact ribosomes.</a> FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mass+spectrometry+of+viral+assemblies:+molecular+composition+and+stability+of+dimorphic+hepatitis+B+virus+capsids.">High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+shape+of+hepatitis+B+virus+capsids+in+vacuo.">Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).</li><li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry.">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=20S+proteasomes+have+the+potential+to+keep+substrates+in+store+for+continual+degradation.">20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).</li><li>van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates.">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring.">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li><li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes.">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid:+insights+from+MS+of+intact+complexes.">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li><li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3.">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li></ol>

För att få hög kvalitet spektra uppmärksamhet bör ägnas åt steg provberedning, som omfattar prov koncentration och buffert utbyte. Under spädda prover kommer att ge en låg signal, medan starkt koncentrerade prover kan vara ganska trögflytande, och blockera elektrospray nålen. Dessutom lösning tillsatser som salter, glycerol, tvättmedel, metalljoner och reduktionsmedel (DTT eller β-merkaptoetanol), tenderar att ansluta sig till den yttre ytan av proteiner, och orsakar breddning av topparna. Därför, i syfte att uppnå väl löst toppar, bör dessa komponenter läggas till lägsta koncentrationer som möjligt. En annan viktig parameter är placeringen av nanoflow kapillär, i förhållande till masspektrometer öppning. Att hitta den &quot;sweet spot&quot; kan vara en utmaning för oerfarna användare, men trots det betydligt påverkar kvaliteten på Spectra. Det är också viktigt att undersöka nanoflow kapillär före initiering av spray. Droppstorleken är en funktion av spetsen diameter, som bör vara ~ 1μm. Små droppar leder till effektivare jonisering, och skulle därför vara fördelaktigt. Det är också viktigt att kontrollera att det inte finns några luftbubblor i kapillär som kan blockera flödet, och att guldet beläggningen inte är strippad från kapillär vid förvärvet och i så fall ytterligare trimma spetsen. Tänk på att en överdriven mängd av provet kommer att öka möjligheten att optimera MS villkor såsom kapillär spänning, accelererande spänning, tryck, och kollision energi. Sammantaget har de förfaranden som beskrivs i det protokoll som använts för att bestämma sammansättningen, stökiometri och arkitektur av många proteinkomplex (se recensioner 2,3,4). Analys av stora MDA komplex som ribosomer 19 och mycket beställde capsids virus 20-22, vid fastställandet av substrat bindning till molekylära maskiner 23-25, eller karakterisering av nätverk subenheten interaktion 26,17,16,17,27,28 fungera som men några exempel på värdet av denna strategi.

Exempel på krav: <table border="1"><tr><td> Exempel på </td><td> Krav </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Volym </td><td> 1-2 mikroliter </td><td> Per kapillär </td></tr><tr><td> Koncentration </td><td> 1-20 mikroM </td><td> Per komplexa </td></tr><tr><td> Buffer </td><td> Aquanos flyktiga buffert som ammoniumacetat vid pH = 6 till 8 </td><td> Normalt 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Tvättmedel </td><td> Minimal </td><td> Kluster av tvättmedel molekyler producera bred och olösta toppar </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Minimal (upp till 5%) </td><td> Fäster ospecifikt till proteiner och därmed breda toppar observeras </td></tr><tr><td> Organiska lösningsmedel </td><td> Upp till 50% </td><td> Kan denaturera proteiner komplex </td></tr><tr><td> Syror </td><td> Upp till 4% </td><td> Denaturera proteinkomplex </td></tr><tr><td> Salter </td><td> Minimal </td><td> Salt addukter leda till en bred och olösta toppar </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Minimal </td><td> 1-2 mikroM kan finnas </td></tr><tr><td> Kelatbildare </td><td> Minimal </td><td> Över 250 mikroM leda till omfattande addukt bildning </td></tr></table>

analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry

Levande celler kontrollera och reglera deras biologiska processer genom samordnade insatser av ett stort antal proteiner som ihop sig i en rad dynamiska, multi-protein komplex 1. För att få en mekanistisk förståelse av de olika cellulära processer är det viktigt att bestämma strukturen av sådana proteinkomplex, och avslöja hur deras organisationsstruktur dikterar deras funktion. Många aspekter av multi-protein komplex är dock svårt att karakterisera på grund av sin heterogena natur, asymmetrisk struktur och dynamik. Därför är nya metoder krävs för att studera den tertiära nivåerna av protein organisation. En av de framväxande strukturbiologi verktyg för att analysera makromolekylära komplex är masspektrometri (MS) 2-5. Denna metod ger information om de komplexa protein sammansättning, subenhet stökiometri, och strukturella topologi. Kraften i MS följd av dess höga känslighet och, som en följd av låga prov krav, som möjliggör granskning av proteinkomplex som framfördes vid endogena nivåer. En annan fördel är hastigheten av analys, som möjliggör övervakning av reaktioner i realtid. Dessutom kan tekniken mäta samtidigt egenskaper hos olika populationer samexisterande i en blandning. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för tillämpning av strukturella MS för analys av stora protein församlingar. Proceduren börjar med förberedelserna av guld-belagd kapillärer för nanoflow elektrospray jonisation (nESI). Det fortsätter sedan med provberedning, med betoning på bufferten villkor som bör vara förenligt med nESI å ena sidan, och gör det möjligt att upprätthålla komplex intakta på den andra. Vi förklarar då steg för steg hur man kan optimera de experimentella förutsättningar för hög massa mätningar och skaffa MS och tandem MS spektra. Slutligen kartlägger vi databearbetning och analyser som följer. Hellre än att försöka beskriva varje aspekt av protein församlingar, införs i detta protokoll grundläggande MS-förfaranden, vilket gör att resultatet för MS och MS / MS experiment med icke-kovalenta komplex. Sammantaget är vårt mål att ge forskare obekant med området strukturella MS, med kunskap om de viktigaste experimentella verktyg.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Masspektrometri har visat sig vara ett värdefullt verktyg för analys av stora proteinkomplex. Denna metod ger insikter om sammansättning, stökiometri och övergripande arkitektur av multi-subenhet församlingar. Här beskriver vi, steg för steg, hur du utför en strukturell analys masspektrometri, och karakterisera makromolekylära strukturer.

Analysera stora proteinkomplex från struktur-masspektrometri

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Provberedning: Ultra tunt lager Metod

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

T-vågen Ion Mobility-masspektrometri: Grundläggande experimentell Rutiner för Protein Komplex analys

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Atmosfäriskt tryck Molecular Imaging av biologisk vävnad och Biofilmer av LAESI masspektrometri

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Direkt analys av enskilda celler med masspektrometri vid atmosfärstryck

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Profilering av metyltransferaser och andra S-Adenosyl- L-Homocystein-bindande proteiner av Capture Compound masspektrometri (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Tiol Redox Proteome Användning Isotope spektrometri Taggning Mäss

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Ett protokoll för identifiering av protein-proteininteraktioner Baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolisk märkning, immunoutfällning, kvantitativa masspektrometri och Affinity modulering

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-fri Metod för bindningsaffinitet Bestämning genom Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

En ny metod för jämförande analys av multiproteinkomplex baserat på<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolic Märkning och kvantitativ masspektrometri

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...