Name: analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00
Duration: 15 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Yazarlar Sharon grup üyeleri, eleştiri ve el yazması katkıları için teşekkür ederim. Biz destek için Morasha ve Bikura Programlar, İsrail Bilim Vakfı (Grant No 1823-1807 ve 378/08), Biomembrane Araştırma Josef Cohn Minerva Merkezi, Yeni bilim adamları için Chais Aile Fellows Programı, İbrahim minnettarız Sonia Rochlin Vakfı; Wolfson Aile Charitable Trust, Helen ve Milton A. KimmelKimmelman Merkezi Biyomoleküler Yapı ve Meclis için; Shlomo ve Sabine Beirzwinsky emlak; Meil ​​de Botton Aynsley, ve Karen Siem Reap, İngiltere. Biz, bize lektin varyant örnek vermek için, Dan Tawfik ve Itamar Yadid minnettar.

Bölüm 1: nanoflow elektrosprey iyonizasyon için altın kaplı kılcal damarların hazırlanması Non-kovalent kompleksleri analizi genellikle cam veya kuvars kılcal damarları (genellikle altın) (~ 1 mm iç çapı), ince bir ucu iletken bir malzeme ile kaplı çekti kullanarak, nanoflow elektrosprey iyonizasyon (Nesi) 6 tarafından yapılır . Böyle kılcal damarların ticari kaynaklardan (Yeni Amaç veya Proxeon) kullanıma hazır olmakla birlikte, in-house onları hazırlamak için daha fazla maliyet-etkin olabilir: <ol><li> Iki altına 2 cm arayla bir Petri kabı, çift taraflı yapışkan şeritler sopa. Pedleri birinin merkezinde bir cam çubuk (8 cm x 5 mm) yerleştirin. Yerinde kılcal damarlar yapışkan yapacak ve cam çubuk hazırlanan kılcal damarların destek ve kırılma (Şekil 1) ipuçları devam edecektir. </li><li> (Hayır. G100TF-4 Warner Instruments 500 ince duvar borosilikat paketler, kedi.) Borosilikat cam kapilerleri, 1.0 mm OD x 0.78 mm id kullanın. Bir iğne çektirmenin kapiller (Sutter Instrument Co model P-97) içine yerleştirin. İğne çektirmesi ısıtma filament merkezi yatıyor böylece yerine hafifçe kılcal Kelepçe, ve kendi konumunu ayarlamak. Kılcal her iki uçta da firmanın düzenlenen kadar kelepçeler, yavaşça sıkın. </li><li> Önceden tanımlanmış bir program kullanarak, kılcal çekin. Çekti Her kılcal son iki şeklindeki kılcal damarların yol açacaktır. Kabul edilebilir bir ucu şeklini elde edilinceye kadar çektirmenin programlama süreci, deneme-yanılma biri. Biz şu programı kullanabilirsiniz: <table border="1"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Isı </td><td> Çekme </td><td> Vell </td><td> Zaman </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Cihazdan çekti kılcal damarları çıkartın ve ipuçları, iptal etme, deforme olmuş veya kırık olduğunu herhangi bir kontrol edin. Petri kabındaki kılcal damarların yer künt cımbız (CK Hassas konumlandırma cımbız kullanın) kullanın. Kapiller tabanı yapışkan bağlı olmalı ve üst kısmı yukarı bakacak ucu, cam çubuk dayanmak gerekir. </li><li> Petri kabı sonra (80, 10 cm çaplı çanak içine kılcal damarların uyum hakkında) dolu, (biz bir model kullanır. EMS550, EMS) coater sputter altın bir tabak yerleştirin. Gaz kaynağı (5 x 10 -2 mbar, 45mA güncel bir vakum basıncı, 4 psi Argon basınç kullanın ve bir kaplama zaman üreticinin talimatlarına göre seçilmiş ve önceden tanımlanmış bir kaplama döngüsü etkinleştirmek olduğundan emin olun . 1 dakika, 3-6 döngüleri için, kılcal damarlar kadar) eşit altın. </li></ol> Bölüm 2: Örnek hazırlama <ol><li> Düşük örnek mikromolar konsantrasyonları (1 - 20 mcM) ihtiyaç vardır. Gerekirse, santrifüj ultrafiltrasyon cihazlar (örneğin, Sartorius Vivaspin veya NanoSep Pall Corporation) kullanarak örnek konsantre. Kullanmadan önce, cihaz membran protein kompleksi adsorpsiyon doğrulamanız önerilir. </li><li> Genellikle, arıtma tamponlar veya protein kompleksi depolama çözümleri için sadece uçucu çözümler olabilir Nesi ile uyumlu değildir. Bu nedenle, tampon değişimi gereklidir. Bu kritik adım, tuzlar, tampon molekülleri veya gliserol, DTT ya da EDTA gibi diğer uçucu olmayan adducts tüm izlerini defedildiği spektrumlarının kalitesini belirler. Genellikle, sulu amonyum asetat çözeltisi, kullanılan 5 mM ve 1 M arasında bir konsantrasyon ve pH değerlerinde 6-8. Tampon döviz mikrosantrifüj jel filtrasyon sütun (örneğin, Mikro Bio-Bio-Rad Spin 6 kromatografi kolon) kullanılarak yapılabilir. Bu adım, minimum seyreltme (cihaz 5 başına 1.3 kat daha az) ile maksimum döviz elde edilene kadar 1-3 kez tekrar edilebilir. Hem de konsantrasyonu ve tampon değişimi gerekiyorsa, bu santrifüj ultrafiltrasyon (e Pall Corporation, g., Sartorius Vivaspin, ya da NanoSep) ile birlikte yapılabilir olabilir. </li></ol> Bölüm 3: yüksek kitle ölçümleri için kütle spektrometresi Kalibre Çok protein kompleksleri üzerinde yapılan deneylerin çoğu nano elektrosprey kuadropol-time-of-flight (Q-TOF) aracı kullanılarak yapılmaktadır. Iyonlarının yüksek m / z değerleri 7,8 ile iletim ve kitle analizi sağlamak için, düşük frekanslar için ayarlanabilir bir quadrupole kütle filtre kullanmanız tavsiye edilir. .ayrıca gaz girişleri 7,8 veya kollu 9 ilk vakum aşamada basınç kontrolü sağlamak için, ilk iyon kılavuzu enstrüman olması önerilir. Sonuncusu optimizasyonu, iletim ve çok büyük iyonları 7-9 desolvation sağlar. Şu anda, ticari ESI-TOF ve Q-TOF aletleri, yerli MS uygulamaları 7,8, nispeten kolay ve maliyet etkin bir şekilde modifiye edilebilir birkaç üreticileri (örneğin, Waters, SCIEX, Bruker veya Agilent) mevcuttur . Mümkündür, ancak, donanım değişikliği 5 gerek kalmadan 1 MDA kadar kompleksleri için kütle spektrumları elde etmek için, LCT veya QToF1 (Waters) gibi araçlar üzerindeki standart TOF veya QToF yapılandırmaları kullanmak. Synapt aleti (Waters) aşağıda belirtilen protokol yapıldı. <ol><li> Arıtılmış su, CsI 100 mg / ml solüsyon hazırlayın. CsI ​​tek başına ücret tuz kümeleri gibi yüksek kütle kalibrasyon, (CSI) n Cs için kullanılır + 393 m / z 10,000 &#39;in üzerinde (Şekil 2), çok geniş bir kitle yelpazesi uzatmak. </li><li> Künt cımbız kullanarak, bir Eppendorf GeLoader ucunu kullanarak, kılcal Petri kabı ve CsI çözüm yük 2μL kaplı kılcal almak. </li><li> Kılcal kılcal tutucu içine yerleştirin ve kapiler ucu sahibinin kenarından yaklaşık 10 mm uzakta olduğunu bu şekilde ayarlayabilirsiniz. </li><li> Ya da el kılcal ucuna doğru çözüm slayt veya aşağı bir spin adaptörü kullanarak. </li><li> Optik bir mikroskop altında kılcal yerleştirin ve ucu keskin AA-tip cımbız kullanarak düzeltin. </li><li> Kılcal sahibi nanoflow ES arabirimine bağlayın. Kapiller hasar görmesini önlemek için xyz aşamada geriye doğru çevirin ve sahnede aktif konuma itin. Kapiller 1 konulmalıdır - konik delikli 10 mm. </li><li> Sprey başlatılan kadar kılcal gerilimi (1050-1400 V) ve düşük nanoflow basıncı (0,00-,03 bar) uygulayın, daha sonra en az bir değere nanoflow basıncı azaltmak için deneyin. </li><li> Xyz sahne konumu, kılcal gerilim nanoflow basınç ve desolvation gaz akışını ayarlayarak sinyal yoğunluğu optimize edin. </li><li> CsI ​​zirve serisi geniş bir kitle tespit için, hızlanan gerilimler (kılcal 1,3-1,7 kV, örnek koni 80-150V, ekstraksiyon koni 1-3 V, aşağıdaki parametreleri kullanabilirsiniz) optimize edilmelidir. </li><li> Nazik desolvation koşulları, ilk vakum aşamasında desteğini basıncı, kaynak ve analizörü arasındaki gerektiren yüksek kitle iyonlar, iletim optimize etmek için, yükseltilmiş olmalıdır. Bu dikkatle izolasyon vanası (SpeediValve) kısmen kapatarak, kaydırma pompa kaynak vakum hattına iletkenlik azaltarak elde edilebilir. Sinyal yoğunluğu üzerindeki etkisi (genellikle 3,0-6,5 mBar) izlerken optimal noktasını tanımlamak için, ikincisi yapılmalıdır. </li><li> M / z m / z simgesine 15.000 ile 1000 arasında bir mesafeden, 1 tarama / sn &#39;de yaklaşık 30 taramalar toplayın </li><li> Kazanılmasından sonra, uygun bir kalibrasyon tablosunu kullanarak TOF kalibre edin. </li></ol> Bölüm 4: tam protein kompleksleri MS analizi <ol><li> , Örnek yük olarak tanımlanmıştır (Bölüm 3, Bölüm 2-5) ve sprey başlatabilir. </li><li> Sinyal tespit edilene kadar, sprey ilk optimizasyonu (Bölüm 3, Bölüm 6-9) ile başlayın. Sorumlu devletlerin tam konumunu protein bağımlı; ancak böylece, iyon kütle ve ortalama ücret devlet arasındaki ilişkiyi kullanarak, tahmin edilebilir:, (Z ortalama) 10 Z av = 0,0778 √ (m), hangi m dalton kompleks kitle. Karmaşık disosiasyon önlemek için, iyon kaynağı ısı: ya ısıtıcı kapatın veya sıcaklık 40&#39;ın altında tutmak ° C </li><li> Kılcal konumu, örnek koni ve iyon geçişi en üst düzeye çıkarmak için çıkarıcı gerilimler değişir ve spektrumları meydana gelen değişim kontrol edin. 1 V, kılcal gerilimi 1,5 kV: çıkarıcı koni, olası bir başlangıç ​​noktası koni gerilimi 100 V olabilir. Nanoflow basıncı ile birlikte, bu parametrelerin optimize edin. </li><li> Desolvation geliştirmek ve kalan su ve tampon parçaları şerit, önyargı gerilim ve çarpışma hücre gaz basıncı artar. Bu adım, kompleks disosiasyon önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Tipik önyargı gerilimleri bir tuzak gaz akışı ile 1-10 ml / dk (Şekil 3), 10-100 V aralığında. RF ayarı ve kuadropol profili manuel ayar, yüksek kütle iyonları iletimi artırabilir. </li><li> Trap ve Transfer çarpışma enerjileri ayarlayın. Genellikle, yüksek gerilimler, yüksek kütle iyonları (genellikle 10-30 V aralığında) iletimi için gereklidir. Bu noktada, karmaşık çarpışma bağlı disosiasyon önlemek için önemlidir. </li><li> Sonra istikrarlı bir sinyal reached, istikrarlı sprey korurken nanoflow basıncı ve kapiller gerilim, asgari değerler ile azalmış olması tavsiye edilir. </li></ol> Bölüm 5: Tandem kütle spektrometresi: dissociating protein kompleksleri <ol><li> En iyi ve istikrarlı bir sinyal elde edildikten sonra, bir habercisi iyon seçin. Kütle merkezi ve izolasyon genişliği (biz genellikle 12 LM çözünürlük ve 13 ile 15 arasında bir HM çözünürlük) ayarlayın. Yüksek kütle / düşük şarj disosiasyon ürünleri tespit etmek için geniş bir kitle aralığı kullanın. Maksimum seviyeye m / z aralığı ayarlamak önerilir ve sonra istediğiniz değerleri azaltmak. Biz seçilen habercisi iyon izolasyonu daha da doğrulamak için, MS ve MS / MS spektrumları atma öneririz. </li><li> MS / MS gerçekleştirmek için, çarpışma hücre çarpışma enerjisi (CE) ve basıncı artırarak habercisi iyon ayrıştırmaları. Ya tuzak artırın veya 10-20V adımlarla, yavaş yavaş CE aktarın ve 0-5 ml / dk (ortak değerleri) çarpışma gaz basıncını yükseltebilir. Monitör değişiklikleri en iyi aktivasyon koşullarında kadar spektrumları ulaşılır. Yüksek aktivasyon enerjisi, sağlam kompleks bir veya daha fazla alt birimden ayrılma neden ve farklı alt birimden etkileşim yakınlık açıklık olabilir. Biz genellikle daha ağır bir gaz (örneğin, Xe veya SF 6) kullanmanın faydaları bildirilmiş olmasına rağmen, bir çarpışma Tuzak / Transfer hücreleri gaz olarak Argon kullanmak; Ancak, bu gazlar (Şekil 3) 11 önemli ölçüde daha pahalı. </li><li> Bu birden fazla şarj durumu MS / MS analizi için seçilmiş olması tavsiye edilir. Örtüşen bileşenlerin durumda, tandem MS spektrum bir dizi satın farklı popülasyonlar şarj serisi çözümünde yardımcı olacaktır. Ayrıca, yüksek şarj devletlerin daha düşük bir şarj devletler 12 ile karşılaştırıldığında, daha kolay ayrıştırmaları. </li><li> Sağlam kompleks karakterizasyonu yanı sıra, hafif denatüre edici koşullar altında, küçük subcomplexes çözüm olacağını tavsiye edilir. Subcomplexes, MS ve MS / MS analizleri karmaşık 13 altbirim mimarisi tanımlamak için temel oluşturur. Subunit altbirim etkileşimleri kısmi kesinti için, yavaş yavaş% 50 bir konsantrasyon organik çözücüler (örneğin, metanol, izopropanol, ya da asetonitril) eklemek, ya da amonyak veya formik asit (4 bir konsantrasyon ekleyerek çözeltinin pH değişikliği %). </li><li> Kompleksi oluşturan bireysel altbirimden kitleleri belirlemek için, denatüre edici koşullar altında bir spektrum elde etmek için önemlidir. Bu elüsyon çözücü olarak% 1 formik asit, 25:75 su / asetonitril oranı ile ZipTip C 4 (Millipore) kullanılarak yapılabilir. </li></ol> Bölüm 6: Veri işleme ve analiz <ol><li> Veri MS spektrumları, spektral analiz programları kullanarak, çevrimdışı analiz edilir. Biz normalde MassLynx programı (Waters) kullanın. </li><li> Geniş bir m / z aralığı yayılan spektrumları için, bu bölgelerin en yüksek çözünürlük farkı yansıtmak için, yüksek ve düşük m / z bölgeler için yumuşatma ve ağırlık parametreleri farklı planları uygulanabilir öneririz. </li><li> Şarj serisi şarj devletler ve kitleler belirlemek ve hesaplamak için MassLynx fonksiyonu uygulanabilir &quot;manuel&quot;. Çakışan bileşenler ile karmaşık bir kütle spektrumlarının durumlarda, elle hesaplama kitlelerin daha kolay olabilir. </li><li> Bu atama işlemleri kolaylaştırmak için, ek bir yazılım olabilir, örneğin: spektrumları deconvolution 14, zirve montaj ve simülasyon 15 için SOMMS, protein subcomplexes kompozisyon ve stokiyometri atama ve protein etkileşim ağları üreten 13,16,17 ZİRVESİ için MaxEnt . </li></ol> Bölüm 7: Temsilci Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Altın kaplı nano-elektrosprey kılcal damarların hazırlanması. A. Petri kabı, 2 cm arayla iki adet çift taraflı yapışkan bantlar takın . B. hazırlanan kılcal damarlar destek için, yapışkan hazırlanan kılcal damarların künt sonunda Çubuk pedleri birinin merkezinde bir cam çubuk (8 cm x 5 mm) yerleştirin ve cam çubuk ucu yalın. C. Petri kabı, altın bir ince film eşit kılcal damarların dış yüzey üzerinde biriken kadar altın ile hazırlanan kılcal damarlar, mont ile doludur . <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Sezyum iyodür iyonları kullanarak yüksek kütle kalibrasyonu. CsI ​​büyük ve monisotopic kümeleri yüksek kitle analizi için kütle spektrometre kalibre için tercih edilen bileşik yaptık. Eşit aralıklı zirvelerinden dizi m / z 393 den 10,000 &#39;in üzerinde, geniş bir yelpazede uzatmak. Onlar assigned tek başına genel bileşimi (CSI) n Cs + tuz kümeleri ücret. Önemli zirveleri arasında Ek sinyaller serisi çift ve üçlü ücret türler neden olur; [(CSI) n Cs2] 2 + ve 3 +, sırasıyla [(CSI) n CS3]. Ilk vakum aşamada basıncı artırarak yüksek kitle kümeleri tespit için esastır. Paneller bir yüksek kütle tepeleri üzerinde basınç etkisi olduğunu göstermiştir. B. sırasıyla 1.2 ve 5.3, basınç readbacks ile C. Tayf genişletilmesi B gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Pentameric lektin Nanoflow elektrosprey kitle spektrumu. A. lektin varyant kompleks Kütle spektrometresi (Lib1-B7 yönlendirilmiş evrim 18 türetilmiş) şarj durumu dağılımları, 3.000 ve 5.000 m / z arasında bir yol verir, ancak iyonları yetersiz desolvation nedeniyle, zirveleri geniş . Karşılaştırma paneli A. ve B. 4V (A) (B) pik genişliği 15V kutuplama gerilimi artan etkisini gösteriyor. Koşullarında hızlanan bu artış, yüksek çözülmesi spektrum verimli, kalan su ve tampon parçaları sıyırma neden olur. Ölçülen kütle (60,240 ± 38 Da) pentameric kompleksine karşılık gelir. C. 15 şarj durumu için tandem MS analizleri (Panel B gri gölgeli.) D seçildi. Çarpışma enerjisi artış 5.000 aralığında, 1664 m / z merkezli bir yüksek tahsil monomer, ve elimden tetramerik kompleksi salınımına neden olur - 8.000 m / z simgesine Tüm spektrumları 0,5 M amonyum asetat 20 mcM çözüm içeren bir örnek elde edildi.

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complexes+in+the+gas+phase:+technology+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics.</a> Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).</li><li>Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+mass+spectrometry:+a+bridge+between+interactomics+and+structural+biology.">Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology.</a> Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).</li><li>Sharon, M., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+spectrometry+in+structure+elucidation+of+dynamic+protein+complexes.">The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).</li><li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry.">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).</li><li>Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+properties+of+the+nanoelectrospray+ion+source.">Analytical properties of the nanoelectrospray ion source.</a> Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).</li><li>Sobott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+mass+spectrometer+for+improved+transmission+and+analysis+of+large+macromolecular+assemblies.">A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies.</a> Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).</li><li>van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+a+quadrupole+time-of-flight+instrument+for+macromolecular+mass+spectrometry.">Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).</li><li>Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collisional+cooling+of+large+ions+in+electrospray+mass+spectrometry.">Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry.</a> Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).</li><li>Mora, d. e. l. a., J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+of+large+multiply+charged+species+proceeds+via+Dole+s+charged+residue+model.">Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model.</a> Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).</li><li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+macromolecular+tandem+mass+spectrometry+of+large+non-covalent+complexes+using+heavy+collision+gases.">Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases.</a> Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).</li><li>Benesch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometer+modified+for+higher-energy+dissociation+reduces+protein+assemblies+to+peptide+fragments.">Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments.</a> Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).</li><li>Taverner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+intact+protein+complexes+from+mass+spectrometry+and+homology+modeling.">Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling.</a> Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).</li><li>Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+MaxEnt+to+high+resolution+mass+spectrometry.">The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).</li><li>van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stoichiometries+and+oligomeric+states+of+glutamate+synthase+protein+complexes+with+curve+fitting+and+simulation+of+electrospray+mass+spectra.">Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+modularity+of+the+COP9+signalosome+complex+suggests+its+multifunctionality.">Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality.</a> Structure. 17 (1), 31-40 (2009).</li><li>Hernandez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+multimeric+complexes+isolated+directly+from+cells.">Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells.</a> EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).</li><li>Yadid, I., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+functional+beta-propeller+lectins+via+homo-oligomeric+assembly+of+shorter+fragments.">Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments.</a> J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).</li><li>Videler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+intact+ribosomes.">Mass spectrometry of intact ribosomes.</a> FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mass+spectrometry+of+viral+assemblies:+molecular+composition+and+stability+of+dimorphic+hepatitis+B+virus+capsids.">High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+shape+of+hepatitis+B+virus+capsids+in+vacuo.">Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).</li><li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry.">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=20S+proteasomes+have+the+potential+to+keep+substrates+in+store+for+continual+degradation.">20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).</li><li>van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates.">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring.">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li><li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes.">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid:+insights+from+MS+of+intact+complexes.">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li><li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3.">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li></ol>

Elde etmek için yüksek kaliteli spektrumları dikkat örnek konsantrasyonu ve tampon değişimi içeren numune hazırlama adımları verilmelidir. Seyreltilmiş örnekleri içinde son derece konsantre örnekler oldukça viskoz ise, düşük sinyal verimi ve elektrosprey iğne bloke olacaktır. Ayrıca, tuzlar, gliserol, deterjan, metal iyonları ve indirgeyici ajanlar (DTT veya β-mercaptoethanol) gibi çözüm katkılar, proteinlerin dış yüzeyi uymak eğilimindedir ve doruklarına genişletilmesi neden. Bu nedenle, iyi bir çözüme doruklarına ulaşmak için, bu bileşenlerin mümkün olan en düşük konsantrasyonlarda ilave edilmelidir. Bir diğer önemli parametre, kılcal nanoflow konumu, kütle spektrometresi orifis göre. &quot;Tatlı nokta&quot; bulma deneyimsiz kullanıcılar için zor olabilir ama yine de spektrumları kalitesini önemli ölçüde etkiler. Nanoflow sprey başlamadan önce kapiller incelemek için de önemlidir. Damlacık boyutu ~ 1 mikrona kadar olmalıdır ucu çapı, bir fonksiyonudur. Küçük damlacıklar daha etkin iyonizasyon kurşun, ve bu nedenle avantajlı olacaktır. Kapiller içinde herhangi bir hava kabarcığı akışını engellemek olduğunu doğrulamak için de önemlidir ve altın kaplama satın alma sırasında kapiller elimden olmadığını, eğer öyleyse, daha fazla ipucu düzeltin. Aşırı miktarda örnek kılcal gerilim, hızlanan gerilimler, basınç, ve çarpışma enerjisi gibi MS koşulları optimize olasılığı artacağı göz önünde bulundurun. Genel olarak, protokol açıklanmıştır usul, sayısız protein kompleksleri bileşimi, stokiyometri ve mimari (bkz. yorumlar 2,3,4) belirlemek için kullanılır olmuştur. Ribozom 19 gibi büyük MDA kompleksleri ve yüksek sipariş virüs capsids 20-22, analizi, moleküler makineler 23-25, veya subunit etkileşim ağları karakterizasyonu için bağlayıcı substratı tanımlayan 26,17,16,17,27,28 olarak hizmet ancak bu yaklaşımın değeri birkaç örnek.

Örnek gereksinimleri: <table border="1"><tr><td> Örnek </td><td> Gereklilik </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Hacim </td><td> 1-2 mcL </td><td> Kapiller Başına </td></tr><tr><td> Konsantrasyon </td><td> 1-20μM </td><td> Karmaşık Başına </td></tr><tr><td> Tampon </td><td> Amonyum asetat gibi Aquanos uçucu tampon pH = 6-8 </td><td> Tipik olarak 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Deterjan </td><td> En az </td><td> Deterjan moleküllerinin Kümeleri geniş ve çözülmemiş doruklarına üretir </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Minimal (5%) </td><td> Nonspecifically proteinlere yapışır ve, dolayısıyla, geniş doruklarına gözlenmektedir </td></tr><tr><td> Organik solventler </td><td> % 50&#39;ye varan </td><td> Proteinler kompleksleri denatüre olabilir </td></tr><tr><td> Asitler </td><td> En fazla% 4 </td><td> Denatüre protein kompleksleri </td></tr><tr><td> Tuzlar </td><td> En az </td><td> Tuz adducts geniş ve çözülmemiş zirveleri </td></tr><tr><td> DTT </td><td> En az </td><td> 1-2 mcM mevcut olabilir </td></tr><tr><td> Şelat ajanları </td><td> En az </td><td> 250 mcM şeyden önce kapsamlı adduct oluşumuna yol </td></tr></table>

analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry

Yaşayan hücreler kontrol ve dinamik, çok protein kompleksleri 1 bir diziye kendilerini bir araya proteinlerin çok sayıda koordineli eylemler yoluyla kendi biyolojik süreçleri düzenlemektir. Çeşitli hücre süreçlerini mekanistik bir anlayış kazanmak için, bu tür protein komplekslerinin yapısını belirlemek ve yapısal organizasyon işlevi dikte nasıl ortaya çıkarmak için çok önemlidir. Pek çok açıdan çok protein kompleksleri, ancak, heterojen doğası, asimetrik yapısı ve dinamikleri nedeniyle karakterize etmek zor. Bu nedenle, yeni yaklaşımlar, protein örgütün üçüncül düzeylerinin çalışması için gereklidir. Makromoleküler kompleksleri analiz etmek için ortaya çıkan yapısal biyoloji araçlarını Bir kütle spektrometresi (MS), 2-5 . Bu yöntem karmaşık protein bileşimi, altbirim stokiyometri ve yapısal topolojisi hakkında bilgi verir. MS güç bir sonucu, düşük örnek gereği olarak, endojen düzeyde ifade protein komplekslerinin incelenmesi, yüksek hassasiyet sağlar türemiştir. Diğer bir avantajı, hız, analiz, gerçek zamanlı olarak reaksiyon izlenmesine olanak sağlar. Ayrıca, teknik, aynı zamanda ortak mevcut bir karışımı ayrı popülasyonlarının özelliklerini ölçmek. Burada, biz, büyük protein meclislerinin analizi, yapısal MS uygulama için ayrıntılı bir protokol açıklar. Prosedürü nanoflow elektrosprey iyonizasyon (Nesi) altın kaplı kılcal damarların hazırlanması ile başlar. Daha sonra bir yandan Nesi ile uyumlu olması, ve diğer taraftan sağlam kompleksler korumak için tampon koşulları vurgulanarak, numune hazırlama ile devam ediyor. Daha sonra açıklayacağım, adım adım yüksek kitle ölçümleri için deneysel koşullar optimize etmek ve MS ve tandem MS spektrumları elde etmek için nasıl. Son olarak, veri işleme ve takip analizleri tablosu. Protein meclislerinin her yönüyle karakterize etmek için çalışmadan ziyade, bu protokol, non-kovalent kompleksleri MS ve MS / MS deneyler performans sağlayan, temel MS prosedürleri tanıtır. Genel olarak, hedefimiz, temel deneysel araçları bilgi, yapısal MS alanında tanışmamak araştırmacılar sağlamaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry at JoVE.com

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Kütle spektrometresi büyük protein kompleksleri ve analiz etmek için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntem, çok-altbirim meclislerinin bileşimi, stokiyometri ve genel mimari içgörüler sağlar. Burada, tarif, adım-adım yapısal bir kütle spektrometresi analizi gerçekleştirmek ve makromoleküler yapıları karakterize etmek için nasıl.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

analyzing-large-protein-complexes-by-structural-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biyoloji

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Atmosferik basınç Moleküler Görüntüleme LAESI Kütle Spektrometresi Biyolojik Dokular ve Biyofilmler

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...