Name: in-vivo detection of protein-protein interactions on micro-patterned surfaces
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00
Duration: 7 min 42 s
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Gostaríamos de agradecer Quentina Beatty, da Universidade de Linz, na Áustria, por sua ajuda tipo, Katharina Strub, Universidade de Genebra, na Suíça, para a construção hCD71-GFP, e Legler Daniel, Universidade de Konstanz, na Suíça, para o GPI-GFP DAF-construir. Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Ciência Austríaco (FWF; projeto Y250-B03) eo projeto GEN-AU do Ministério Federal Austríaco da Ciência e Investigação.

Impressão microcontact: <ol><li> Cortar campo de micropattern do selo PDMS utilizando um bisturi </li><li> Lave o campo que contém o micropattern através de lavagem com etanol (100%) e água destilada. </li><li> Seque o selo PDMS com nitrogênio ou gás argônio. </li><li> Pipetar 50 ul BSA-Cy5 solução de trabalho (0,67 mg / ml) para o selo de PDMS para que o campo micropattern inteiro é coberto com a solução. Incubar por 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Lavar o campo micropattern através de lavagem com Tampão fosfato salino (PBS) e água destilada. </li><li> Seque o PDMS com nitrogênio ou gás argônio. </li><li> Coloque o selo PDMS sob seu próprio peso sobre o centro de uma lamela epoxy revestido e incubar por 30 min à temperatura ambiente numa placa de Petri. </li><li> Rotular a posição do carimbo PDMS na parte traseira da lamela e tira o selo do slide com uma pinça. </li><li> Vara uma câmara de hibridação Seguro Selo sobre o campo microcontact-impresso na lamela. O rótulo de ajuda para localizar o centro do campo. </li><li> Pipetar 60 mL de solução de trabalho estreptavidina (50 mcg / ml) para a câmara de reação e incubar a amostra por 60 min em temperatura ambiente. </li><li> Lavar a amostra com 1 ml de PBS, adicionando o buffer em uma porta da câmara e removê-lo simultaneamente a segunda porta com uma bomba. </li><li> Pipetar 60 mL de solução de trabalho biotinilado anticorpo (10 mg / ml em PBS suplementado com 0,1% Tween 20; &quot;PBST&quot;) para a câmara de reação e incubar por 60 min em temperatura ambiente. </li><li> Lavar a amostra com 1 ml PBST e, posteriormente, 1 ml de PBS, adicionando o buffer em uma porta da câmara e removê-lo novamente na segunda porta com uma bomba. </li><li> Armazenar as superfícies micropatterned em PBS no escuro à temperatura ambiente até que as células estão prontos para a semeadura. </li></ol> Incubação de células na superfície micropatterned: <ol><li> Cultivar células aderentes à confluência de 50% em um 3 centímetros placa de cultura de tecidos. </li><li> Separar células que expressam a isca presa e proteínas de interesse, com solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e centrifugar 5 min a 1.000 rpm. </li><li> Desprezar o sobrenadante e dissolver o celular em meio de crescimento de acordo. </li><li> Centrifugar 5 min a 1.000 rpm. </li><li> Desprezar o sobrenadante e dissolver o pellet celular em meio de crescimento adequado. </li><li> Trocar o PBS da câmara de reação na lamela micropatterned em 60 mL da suspensão de células. </li><li> Criar uma câmara úmida por imersão uma almofada em água destilada estéril e colocá-lo na placa de Petri para evitar que a amostra de funcionamento a seco. </li><li> Incubar as células ao longo da noite a 37 ° C em uma atmosfera de 5% CO 2 na superfície micropatterned. </li><li> Antes de analisar as células no microscópio, a troca do meio de solução de Hank s sal tamponado incluindo Ca 2 + e Mg 2 +. </li></ol> Microscopia: <ol><li> A lamínula é colocada sobre um suporte adequado ea morfologia das células é verificada em branco-luz. </li><li> A qualidade da BSA-Cy5 é marcada por padrões de excitação em 647 nm. </li><li> Micropadrões de proteína presa fluorescente (GFP ou YFP) são registrados a 488 ou 514 nm sob Total Internal Reflection excitação (TIR). </li></ol> Resultados representativos: Se não houver interação entre as proteínas-alvo em células cultivadas em uma superfície micropatterned, a presa vai seguir a redistribuição isca. O micropattern resultante pode ser visualizado pelo rótulo de fluorescência da proteína presa. Importante é que o contraste obtido fornece uma medida direta da força de interação (ver Figura 1). Portanto, uma simples avaliação da interação de duas proteínas torna-se possível - sem a necessidade de continuar a processar os dados medidos primária. <img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Rearranjo da isca na membrana plasmática de células vivas em dosagens diferentes de interação. Imagens TIR de células transfectadas com T24 (a) CD71-GFP em anticorpos CD71, (b) CD4 e YFP citosólica em CD4-anticorpo e (c) GPI-GFP-DAF em anticorpos CD59 microbiochips são mostrados. Os dados são característicos para a forte (a), não (b) ou interação fraca (c). (A) é reproduzida a partir de (Weghuber et al., No prelo), (b) a partir de (Schwarzenbacher et al., 2008).

<ol>
	<li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to+"Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments.">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li><li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8.">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li><li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+screening:+a+technology+in+transition.">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li><li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li><li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning.">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , .</li></ol>

O vídeo contém imagens que foram fornecidos pela Olympus, a partir da homepage do Laboratório de Pesquisa Visualization, da Universidade Brown ou reproduzidas a partir de (Kim et al., 2003).

O vídeo que acompanha demonstra um método para a detecção de interações proteína-proteína na membrana plasmática de células vivas (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). Em princípio, qualquer plataforma de microscopia TIRF baseada pode ser usado como sistema de leitura. Somente quando de alta sensibilidade é desejada (por exemplo, para a detecção de moléculas simples), microscópios avançados serão necessários. Para alcançar melhores resultados os seguintes pontos críticos durante o processo de preparação requerem uma atenção especial: <ol class="lroman"><li> Solução de loja Cy5 estoque em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo e preparar o BSA-Cy5 solução de trabalho imediatamente antes da impressão microcontact. </li><li> Tenha cuidado para não arranhar a micropattern no PDMS com a ponta da pipeta e incube a amostra em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo. </li><li> Coloque a lamínula sobre uma almofada esterilizada para evitar que grudem da lâmina de vidro para a placa de Petri. Uma vez que o carimbo de PDMS se adere à lâmina de vidro, não movê-lo. </li><li> Evite bolhas de ar na câmara de reação e incubar a amostra em condições escuras, para evitar o branqueamento do fluoróforo. </li><li> Não deixe que a amostra seca por mais de 2 minutos para evitar a formação de cristais de sal. </li><li> Para o desprendimento das células não utilizar de tripsina, uma vez que irá unir o domínio extracelular de proteínas da membrana, até agora manifestado. Evitando tripsina será útil para proteínas com baixo índice de rotatividade para formar micropadrões imediatamente após fixação das células na superfície. </li><li> Controlar o número de células incubadas em um microscópio e certifique-se que as células não alcançam mais do que 30-50% confluência. Certifique-se que as células excessivo são removidos imediatamente, devido à fixação rápida de células na superfície revestidos com anticorpo. </li><li> Slides apenas com alta qualidade BSA-Cy5 padrões podem ser usados ​​para análise posterior. </li><li> Expressão estável da proteína fluorescente presa é preferível devido à maior número de células que podem ser analisados ​​por varredura. </li><li> Ajuste TIRF adequada é indispensável para visualizar padrões devido ao fundo citosólica. </li></ol> A técnica de micro-padronização oferece diversas possibilidades para a análise das interações proteína-proteína. Em primeiro lugar, juntamente com a quantificação do local, espacialmente resolvidos interações proteína-proteína também a detecção de interações fracas ou indirecta é possível sem a desvantagem de dar um elevado número de falsos positivos ou negativos. Em segundo lugar, permite ao pesquisador analisar interações proteína-proteína na membrana plasmática de células vivas, que é difícil de conseguir por abordagens bioquímicas como a tela de 2 híbridos. Em terceiro lugar a abordagem permite a detecção de isca presa interações que são modulados por mudanças ambientais, como a temperatura, a presença de diferentes proteínas ou outras moléculas ou modificações pós-translacionais. Assim, o ensaio permite a moduladores de triagem de um par de interação dada no contexto de células vivas. Além disso, ao reduzir a densidade de superfície do ligante captura ou o uso de ligantes monovalentes, a análise do estado de repouso se torna possível. Finalmente, se adequado plataformas de digitalização são utilizados, o número de células analisadas é alta o suficiente para atender as demandas de alto rendimento das empresas farmacêuticas para a triagem de drogas (Ramm, 2005).

in-vivo detection of protein-protein interactions on micro-patterned surfaces

Desvendar a rede de interação de moléculas<em&gt; In-vivo</em&gt; É a chave para a compreensão dos mecanismos que regulam a função celular e metabolismo. Uma multidão de opções metodológicas para tratar as interações moleculares nas células têm sido desenvolvidas, mas a maioria destes métodos sofrem de ser bastante indireta e, portanto, dificilmente quantitativa. Pelo contrário, alguns high-end abordagens quantitativas foram introduzidas, que no entanto são difíceis de estender a alta taxa de transferência. Para combinar as capacidades de alto rendimento com a possibilidade de extrair informações quantitativas, que recentemente desenvolveu um novo conceito para a identificação de interações proteína-proteína (Schwarzenbacher<em&gt; Et al</em&gt;., 2008). Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a concepção e construção deste sistema que permite analisar as interações entre um fluoróforo marcado com proteína (&quot;presa&quot;) e uma proteína de membrana (&quot;isca&quot;)<em&gt; In-vivo</em&gt;. Células são semeadas em superfícies micropatterned funcionalizados com anticorpos contra o domínio isca exoplasmic. Isca presa interações são analisadas através da redistribuição da presa fluorescente. O método é caracterizado pela alta sensibilidade para o nível de moléculas individuais, a capacidade de detectar interações fracas, e capacidade de produção elevada, tornando-o aplicável como ferramenta de triagem.

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In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Este vídeo mostra experimentos com posterior análise de interações proteína-proteína através da utilização de micro-padrão superfícies. A abordagem oferece a possibilidade de detectar as interações de proteínas em células vivas e combina alta capacidade de processamento com a possibilidade de extrair informações quantitativas.

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

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