För att generera organoid från en enda erytropoietinproducerande hepatocellulär receptor B2, eller FEB2-positiv tarmstamcell, utför fluorescensaktiverad cellsortering baserat på FEB2-uttrycket och dela cellerna erhållna i fyra grupper, hög, medium, låg och negativ. Efter att ha samlat FEB2-högcellspelleten med centrifugering vid 390 G i tre minuter vid fyra grader Celsius, bädda in de enstaka sorterade FEB2-högcellerna i ECM genom pipettering och frö sedan cellerna på en 24-brunnsplatta vid 100 singlets per 40 mikroliter ECM per brunn. Inkubera plattan med 24 brunnar i 15 minuter vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid för polymerisation av ECM.
Därefter täcker ECM med 500 mikroliter odlingsmedium innehållande 10 mikromolärt radassocierat kinas eller rockhämmare under de första två dagarna för att upprätthålla FEB2-högcellerna. Inspektera cellerna manuellt med ett inverterat mikroskop vid 40X förstoring och observera livskraftiga organoider med sfäroidbildning och kryptutsprång. Självorganiserande kryptvillastrukturer som påminner om den normala tunntarmen återskapades från enstaka FEB2-höga celler.
Vid dag fem av kulturen bildades sfäroidliknande strukturer, och från dag sju till dag nio inträffade evagination av fläckarna för att bilda krypter.
