Name: Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay
Uploaded: 2023-05-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay at JoVE.com

The video demonstrates how to process images of PA14 plates containing L4 stage worms using Python and ImageJ. It covers measuring plate dimensions, marking coordinates for cropping videos, saving results, and analyzing worm counts for occupancy rates, highlighting the accuracy of counts from images vs. direct observations.

video processing and manual counting for c. elegans lawn avoidance assay

Imagerie sur smartphone pour le test d’évitement de la pelouse de C. elegans

Among the many advantages of studying C. elegans, its simple nervous system offers the opportunity to study how changes at the genetic and cellular level impact network function and behavioral output. Despite having a limited number of neurons, C. elegans display a wide range of complex behaviors. One of these is lawn avoidance, in which the bacterivorous nematode responds to a harmful food source by leaving the bacterial lawn. C. elegans avoid lawns of pathogenic bacteria1,2,3, lawns of bacteria that produce toxins or are spiked with toxins1,4, and even RNAi-expressing bacteria whose target gene knockdown is detrimental to the health of the worms4,5. Studies have shown that worms respond to external cues such as metabolites produced by the pathogenic bacteria1,6, or internal cues that indicate that the food is making them sick4,7. These cues are processed through conserved signaling pathways, such as the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the transforming growth factor beta (TGF&#946;) pathway, and require communication between the gut and the nervous system4,6,7,8.
Although the assay is simple, the learned behavior develops over many hours, often overnight. While there are mutants that are incapable of leaving, in which case scoring avoidance at just one time point is sufficient to demonstrate the defect, many mutants do leave eventually but are slower to come out. For these, the movement of the worms needs to be tracked every few hours, which can be difficult to do overnight. Counting itself also takes time, creating a lag time between the plates, and thus limits the number of plates that can be tested at the same time. Using an imaging setup to record many plates simultaneously for the whole duration of the assay would be very useful, but the cost of setup can be prohibitive, depending on the funding situation of the research lab.
To address this, we devised a very simple method that uses smartphones to record avoidance assays. Each phone can record time-lapse videos of up to six assay plates. To provide transmitted light, we use a light emitting diode (LED) light box that can be easily purchased online. Assay plates are placed on an elevated platform, supported by hollow rectangular tunnels, that focus the incoming light, creating contrast. We also provide a Python script that converts the videos into audio video interleave (AVI) files showing 10 s clips of each hourly time point. The videos are then cropped to individual plates and saved in separate files to use for manual counting.
The method provides a low-cost procedure that is also extremely easy to use, using items that are readily available to most people. Here, we describe the method using the well-established lawn avoidance assay against the human pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA14), whose protocol has been previously described2,9. Finally, we also review the considerations and limitations of the imaging method for those that want to apply it to other C. elegans behavior experiments.

Pleins feux sur l’auteur : Une méthode d’imagerie basée sur un smartphone pour le test d’évitement de la pelouse de C. elegans  

Une méthode d’imagerie basée sur un smartphone pour le test d’évitement de pelouse de C. elegans

Among the many behaviors displayed by C-elegans, pathogenic lawn avoidance is the worm's defense strategy to minimize its exposure to harmful pathogens. In our lab, we use this behavior as a tool to identify genes involved in the proper functioning of the neurons that mediate this behavior. The lawn avoidance behavior is a simple assay, however it develops over many hours.Hence, it is convenient if the assay can be recorded to observe behavior over long time periods. Also, if multiple assays can be recorded at the same time, that's even better. Although there are many imaging solutions described in the literature, even a few modestly priced cameras may be out of reach for labs with limited resources.Also, some may want to try the assay, but do not plan on doing it long term. For such cases, short-term solutions such as this protocol might help. Our amazing protocol offers an easy, low cost way to record worm behavior.We use smartphones to record the assay, then process the video through a Python script that makes it suitable for counting.

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Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay  

Traitement vidéo et comptage manuel pour C. elegans Test d’évitement de pelouse

Identifiez les dimensions d’une plaque PA14 contenant les vers d’étape L4 en exécutant le script Python extract_frame.py. Ouvrez ensuite le fichier JPEG dans ImageJ. Dans le menu, choisissez Analyser, puis Définir les mesures.Assurez-vous que la case d’affichage de l’étiquette est cochée et fermez la fenêtre. À l’aide de l’outil Ligne droite, mesurez le diamètre d’une plaque en traçant une ligne à travers elle. Choisissez ensuite Analyser, puis Mesurer dans le menu.Si la vidéo est en 1080 pixels, chaque plaque aura une largeur d’environ 480 pixels. Entrez ces informations dans le bloc-notes pour les utiliser ultérieurement et fermez la fenêtre de résultats. À l’aide de l’outil multipoint, marquez les points sur le côté supérieur gauche de chaque plaque qui deviendra le coin supérieur gauche des vidéos recadrées.Marquez-le dans l’ordre de démarrage des plaques. Après avoir créé un point pour toutes les plaques, choisissez Analyser, puis Mesurer dans le menu. Les mesures, y compris les coordonnées X et Y des points, apparaîtront dans la fenêtre de résultats.Pour traiter plusieurs vidéos, répétez le processus dans ImageJ avec d’autres fichiers JPEG. Toutes les coordonnées X et Y seront répertoriées dans la même fenêtre de résultats. Enregistrez la fenêtre de résultats dans un fichier CSV.Le fichier doit être enregistré dans le même répertoire que les fichiers vidéo. Pour trouver l’heure de début de chaque plaque, lisez le film sur l’ordinateur ou le téléphone et notez les heures de début de chaque jeu de plaques placées sous la caméra. Ouvrez les résultats.CSV avec les coordonnées et ajoutez une colonne de démarrage. Pour chaque ligne correspondant à des plaques individuelles, inscrivez l’heure de début appropriée en secondes sous la colonne de départ. Enregistrez le fichier.Pour recadrer et découper les vidéos, exécutez le crop_n_trim. Script PY. Choisissez les résultats.CSV. Entrez les dimensions de la plaque et la valeur en pixels indiquée précédemment. Le script va maintenant lire chaque ligne des résultats.CSV pour trouver le fichier vidéo correct une fois l’exécution du script terminée. Un dossier apparaîtra avec le même nom que le film, suivi de l’heure de début dans laquelle les vidéos correspondant au test seront enregistrées. Pour le comptage manuel, ouvrez chaque fichier AVI dans ImageJ.Comptez les vers visibles à l’extérieur de la pelouse, puis calculez le taux d’occupation pour chaque point temporel. Les vers sauvages de type N2 ont progressivement quitté la pelouse bactérienne et sont restés à l’extérieur, comme indiqué dans le taux d’occupation au fil du temps. Les comptages effectués directement à partir des plaques ont été comparés aux comptages effectués à partir de vers imagés.Les comptages effectués à partir de vers imagés se sont avérés très précis. Lorsque trois essais pour chaque souche ont été moyennés ensemble, les souches N2 et NPR1 ont donné une précision de 99,5% et 96,2% respectivement.

Research

JoVE Journal

Behavior

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...