Name: Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay
Uploaded: 2023-05-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay at JoVE.com

The video demonstrates how to process images of PA14 plates containing L4 stage worms using Python and ImageJ. It covers measuring plate dimensions, marking coordinates for cropping videos, saving results, and analyzing worm counts for occupancy rates, highlighting the accuracy of counts from images vs. direct observations.

video processing and manual counting for c. elegans lawn avoidance assay

Smartphone-basierte Bildgebung für C. elegans Rasenvermeidungs-Assay

Among the many advantages of studying C. elegans, its simple nervous system offers the opportunity to study how changes at the genetic and cellular level impact network function and behavioral output. Despite having a limited number of neurons, C. elegans display a wide range of complex behaviors. One of these is lawn avoidance, in which the bacterivorous nematode responds to a harmful food source by leaving the bacterial lawn. C. elegans avoid lawns of pathogenic bacteria1,2,3, lawns of bacteria that produce toxins or are spiked with toxins1,4, and even RNAi-expressing bacteria whose target gene knockdown is detrimental to the health of the worms4,5. Studies have shown that worms respond to external cues such as metabolites produced by the pathogenic bacteria1,6, or internal cues that indicate that the food is making them sick4,7. These cues are processed through conserved signaling pathways, such as the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the transforming growth factor beta (TGF&#946;) pathway, and require communication between the gut and the nervous system4,6,7,8.
Although the assay is simple, the learned behavior develops over many hours, often overnight. While there are mutants that are incapable of leaving, in which case scoring avoidance at just one time point is sufficient to demonstrate the defect, many mutants do leave eventually but are slower to come out. For these, the movement of the worms needs to be tracked every few hours, which can be difficult to do overnight. Counting itself also takes time, creating a lag time between the plates, and thus limits the number of plates that can be tested at the same time. Using an imaging setup to record many plates simultaneously for the whole duration of the assay would be very useful, but the cost of setup can be prohibitive, depending on the funding situation of the research lab.
To address this, we devised a very simple method that uses smartphones to record avoidance assays. Each phone can record time-lapse videos of up to six assay plates. To provide transmitted light, we use a light emitting diode (LED) light box that can be easily purchased online. Assay plates are placed on an elevated platform, supported by hollow rectangular tunnels, that focus the incoming light, creating contrast. We also provide a Python script that converts the videos into audio video interleave (AVI) files showing 10 s clips of each hourly time point. The videos are then cropped to individual plates and saved in separate files to use for manual counting.
The method provides a low-cost procedure that is also extremely easy to use, using items that are readily available to most people. Here, we describe the method using the well-established lawn avoidance assay against the human pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA14), whose protocol has been previously described2,9. Finally, we also review the considerations and limitations of the imaging method for those that want to apply it to other C. elegans behavior experiments.

Autor im Rampenlicht: Eine Smartphone-basierte Bildgebungsmethode für den Rasenvermeidungs-Assay von C. elegans  

Eine Smartphone-basierte Bildgebungsmethode für den Rasenvermeidungstest von C. elegans

Among the many behaviors displayed by C-elegans, pathogenic lawn avoidance is the worm's defense strategy to minimize its exposure to harmful pathogens. In our lab, we use this behavior as a tool to identify genes involved in the proper functioning of the neurons that mediate this behavior. The lawn avoidance behavior is a simple assay, however it develops over many hours.Hence, it is convenient if the assay can be recorded to observe behavior over long time periods. Also, if multiple assays can be recorded at the same time, that's even better. Although there are many imaging solutions described in the literature, even a few modestly priced cameras may be out of reach for labs with limited resources.Also, some may want to try the assay, but do not plan on doing it long term. For such cases, short-term solutions such as this protocol might help. Our amazing protocol offers an easy, low cost way to record worm behavior.We use smartphones to record the assay, then process the video through a Python script that makes it suitable for counting.

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Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay  

Videoverarbeitung und manuelle Zählung für den Rasenvermeidungstest von C. elegans

Identifizieren Sie die Abmessungen einer PA14-Platte, die die L4-Stage-Würmer enthält, indem Sie das Python-Skript extract_frame.py ausführen. Öffnen Sie dann die JPEG-Datei in ImageJ. Wählen Sie im Menü "Analysieren" und dann "Messungen festlegen" aus.Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Anzeigebeschriftung aktiviert ist, und schließen Sie das Fenster. Messen Sie mit dem geraden Linienwerkzeug den Durchmesser einer Platte, indem Sie eine Linie darüber ziehen. Wählen Sie dann "Analysieren" und dann "Messen" aus dem Menü.Wenn das Video 1080 Pixel groß ist, ist jede Platte etwa 480 Pixel breit. Geben Sie diese Informationen in den Notizblock ein, um sie später zu verwenden, und schließen Sie das Ergebnisfenster. Markieren Sie mit dem Multipoint-Werkzeug Punkte auf der oberen linken Seite jeder Platte, die zur oberen linken Ecke der zugeschnittenen Videos werden.Markieren Sie es in der Reihenfolge, in der die Platten begonnen wurden. Nachdem Sie einen Punkt für alle Platten erstellt haben, wählen Sie "Analysieren" und dann "Messen" aus dem Menü. Messungen, die die X- und Y-Koordinaten der Punkte enthalten, werden im Ergebnisfenster angezeigt.Um mehrere Videos zu verarbeiten, wiederholen Sie den Vorgang in ImageJ mit anderen JPEG-Dateien. Alle X- und Y-Koordinaten werden im selben Ergebnisfenster aufgelistet. Speichern Sie das Ergebnisfenster in einer CSV-Datei.Die Datei sollte im selben Verzeichnis wie die Filmdateien gespeichert werden. Um die Startzeit für jede Platte zu finden, spielen Sie den Film entweder auf dem Computer oder dem Telefon ab und notieren Sie sich die Startzeiten jedes Plattensatzes, der unter die Kamera gelegt wird. Öffnen Sie die Ergebnisse.CSV-Datei mit den Koordinaten und fügen Sie eine Startspalte hinzu. Geben Sie für jede Zeile, die den einzelnen Platten entspricht, die entsprechende Startzeit in Sekunden unter der Startspalte ein. Speichern Sie die Datei.Um die Videos zuzuschneiden und zuzuschneiden, führen Sie die crop_n_trim aus. py-Skript. Wählen Sie die Ergebnisse aus.CSV-Datei. Geben Sie die Plattenabmessungen und den zuvor notierten Pixelwert ein. Das Skript liest nun jede Zeile der Ergebnisse.CSV-Datei, um die richtige Filmdatei zu finden, nachdem das Skript ausgeführt wurde. Es erscheint ein Ordner mit dem gleichen Namen wie der Film, gefolgt von der Startzeit, in der die dem Assay entsprechenden Videos gespeichert werden. Öffnen Sie für die manuelle Zählung jede AVI-Datei in ImageJ.Zählen Sie die Würmer, die außerhalb des Rasens sichtbar sind, und berechnen Sie dann die Belegungsrate für jeden Zeitpunkt. Die Wildtyp-N2-Würmer verließen nach und nach den Bakterienrasen und blieben draußen, wie die Belegungsrate im Laufe der Zeit zeigte. Die Zählungen, die direkt von den Platten gemacht wurden, wurden mit den Zählungen von abgebildeten Würmern verglichen.Die Zählungen der abgebildeten Würmer erwiesen sich als sehr genau. Wenn drei Versuche für jeden Stamm zusammen gemittelt wurden, ergaben die N2- und NPR1-Stämme eine Genauigkeit von 99,5 % bzw. 96,2 %.

Research

JoVE Journal

Behavior

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...