Name: Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay
Uploaded: 2023-05-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay at JoVE.com

The video demonstrates how to process images of PA14 plates containing L4 stage worms using Python and ImageJ. It covers measuring plate dimensions, marking coordinates for cropping videos, saving results, and analyzing worm counts for occupancy rates, highlighting the accuracy of counts from images vs. direct observations.

video processing and manual counting for c. elegans lawn avoidance assay

הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

Among the many advantages of studying C. elegans, its simple nervous system offers the opportunity to study how changes at the genetic and cellular level impact network function and behavioral output. Despite having a limited number of neurons, C. elegans display a wide range of complex behaviors. One of these is lawn avoidance, in which the bacterivorous nematode responds to a harmful food source by leaving the bacterial lawn. C. elegans avoid lawns of pathogenic bacteria1,2,3, lawns of bacteria that produce toxins or are spiked with toxins1,4, and even RNAi-expressing bacteria whose target gene knockdown is detrimental to the health of the worms4,5. Studies have shown that worms respond to external cues such as metabolites produced by the pathogenic bacteria1,6, or internal cues that indicate that the food is making them sick4,7. These cues are processed through conserved signaling pathways, such as the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the transforming growth factor beta (TGF&#946;) pathway, and require communication between the gut and the nervous system4,6,7,8.
Although the assay is simple, the learned behavior develops over many hours, often overnight. While there are mutants that are incapable of leaving, in which case scoring avoidance at just one time point is sufficient to demonstrate the defect, many mutants do leave eventually but are slower to come out. For these, the movement of the worms needs to be tracked every few hours, which can be difficult to do overnight. Counting itself also takes time, creating a lag time between the plates, and thus limits the number of plates that can be tested at the same time. Using an imaging setup to record many plates simultaneously for the whole duration of the assay would be very useful, but the cost of setup can be prohibitive, depending on the funding situation of the research lab.
To address this, we devised a very simple method that uses smartphones to record avoidance assays. Each phone can record time-lapse videos of up to six assay plates. To provide transmitted light, we use a light emitting diode (LED) light box that can be easily purchased online. Assay plates are placed on an elevated platform, supported by hollow rectangular tunnels, that focus the incoming light, creating contrast. We also provide a Python script that converts the videos into audio video interleave (AVI) files showing 10 s clips of each hourly time point. The videos are then cropped to individual plates and saved in separate files to use for manual counting.
The method provides a low-cost procedure that is also extremely easy to use, using items that are readily available to most people. Here, we describe the method using the well-established lawn avoidance assay against the human pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA14), whose protocol has been previously described2,9. Finally, we also review the considerations and limitations of the imaging method for those that want to apply it to other C. elegans behavior experiments.

Author Spotlight: שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay  

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

Among the many behaviors displayed by C-elegans, pathogenic lawn avoidance is the worm's defense strategy to minimize its exposure to harmful pathogens. In our lab, we use this behavior as a tool to identify genes involved in the proper functioning of the neurons that mediate this behavior. The lawn avoidance behavior is a simple assay, however it develops over many hours.Hence, it is convenient if the assay can be recorded to observe behavior over long time periods. Also, if multiple assays can be recorded at the same time, that's even better. Although there are many imaging solutions described in the literature, even a few modestly priced cameras may be out of reach for labs with limited resources.Also, some may want to try the assay, but do not plan on doing it long term. For such cases, short-term solutions such as this protocol might help. Our amazing protocol offers an easy, low cost way to record worm behavior.We use smartphones to record the assay, then process the video through a Python script that makes it suitable for counting.

Watch this Scientific Journal Video about Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay at JoVE.com

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay  

עיבוד וידאו וספירה ידנית עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

זהה את הממדים של לוח PA14 המכיל את תולעי שלב L4 על-ידי הפעלת סקריפט Python extract_frame.py. לאחר מכן פתח את קובץ JPEG ב- ImageJ. מהתפריט, בחרו 'נתח' ולאחר מכן 'קבע מדידות'.ודא שהתיבה תווית תצוגה מסומנת וסגור את החלון. בעזרת הכלי קו ישר, מדדו את קוטר הלוח על-ידי ציור קו לרוחבו. לאחר מכן בחרו 'נתח' ולאחר מכן 'מדדו' מהתפריט.אם הסרטון הוא ב- 1080 פיקסלים, רוחב כל לוח יהיה כ- 480 פיקסלים. הזן מידע זה בפנקס הרשימות לשימוש מאוחר יותר וסגור את חלון התוצאות. באמצעות הכלי הרב-נקודתי, סמן נקודות בצד השמאלי העליון של כל צלחת שיהפכו לפינה השמאלית העליונה של הסרטונים החתוכים.סמן אותו לפי סדר התחלת הצלחות. לאחר יצירת נקודה לכל הלוחות, בחרו 'נתח' ולאחר מכן 'מדידה' מהתפריט. מדידות הכוללות את קואורדינטות X ו- Y של הנקודות יופיעו בחלון התוצאות.כדי לעבד סרטונים מרובים, חזור על התהליך ב- ImageJ עם קובצי JPEG אחרים. כל קואורדינטות X ו- Y יופיעו באותו חלון תוצאות. שמור את חלון התוצאות בקובץ CSV.יש לשמור את הקובץ באותה ספרייה כמו קובצי הסרט. כדי למצוא את שעת ההתחלה של כל צלחת, הפעל את הסרט במחשב או בטלפון ושים לב לזמני ההתחלה של כל סט צלחות שהונחו מתחת למצלמה. פתח את התוצאות.קובץ CSV עם הקואורדינטות והוסף עמודת פתיחה. עבור כל שורה המתאימה ללוחות בודדים, הזן זמן התחלה מתאים בשניות תחת עמודת ההתחלה. שמור את הקובץ.כדי לחתוך ולקצץ את הסרטונים, הפעל את crop_n_trim. סקריפט PY. בחר את התוצאות.קובץ CSV. הזינו את מידות הלוח ואת ערך הפיקסלים שצוין קודם לכן. הסקריפט יקרא כעת כל שורה של התוצאות.קובץ CSV כדי למצוא את קובץ הסרט הנכון לאחר שהסקריפט מסיים לפעול. תיקיה תופיע עם אותו שם כמו הסרט, ואחריו זמן ההתחלה שבו סרטונים המתאימים לבדיקה יישמרו. לספירה ידנית, פתח כל קובץ AVI ב- ImageJ.ספרו את התולעים שנראות מחוץ לדשא ואז חשבו את שיעור התפוסה עבור כל נקודת זמן. תולעי הבר מסוג N2 עזבו בהדרגה את מדשאות החיידקים ונשארו בחוץ כפי שצוין בשיעור התפוסה לאורך זמן. הספירות שנעשו ישירות מהלוחות הושוו לספירות מתולעים מצולמות.הספירות שנעשו מתולעים מצולמות התבררו כמדויקות ביותר. כאשר בוצעו בממוצע שלושה ניסויים עבור כל זן יחד, הזנים N2 ו-NPR1 הניבו דיוק של 99.5% ו-96.2% בהתאמה.

Research

JoVE Journal

Behavior

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...