Name: Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay
Uploaded: 2023-05-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay at JoVE.com

The video demonstrates how to process images of PA14 plates containing L4 stage worms using Python and ImageJ. It covers measuring plate dimensions, marking coordinates for cropping videos, saving results, and analyzing worm counts for occupancy rates, highlighting the accuracy of counts from images vs. direct observations.

video processing and manual counting for c. elegans lawn avoidance assay

Imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

Among the many advantages of studying C. elegans, its simple nervous system offers the opportunity to study how changes at the genetic and cellular level impact network function and behavioral output. Despite having a limited number of neurons, C. elegans display a wide range of complex behaviors. One of these is lawn avoidance, in which the bacterivorous nematode responds to a harmful food source by leaving the bacterial lawn. C. elegans avoid lawns of pathogenic bacteria1,2,3, lawns of bacteria that produce toxins or are spiked with toxins1,4, and even RNAi-expressing bacteria whose target gene knockdown is detrimental to the health of the worms4,5. Studies have shown that worms respond to external cues such as metabolites produced by the pathogenic bacteria1,6, or internal cues that indicate that the food is making them sick4,7. These cues are processed through conserved signaling pathways, such as the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the transforming growth factor beta (TGF&#946;) pathway, and require communication between the gut and the nervous system4,6,7,8.
Although the assay is simple, the learned behavior develops over many hours, often overnight. While there are mutants that are incapable of leaving, in which case scoring avoidance at just one time point is sufficient to demonstrate the defect, many mutants do leave eventually but are slower to come out. For these, the movement of the worms needs to be tracked every few hours, which can be difficult to do overnight. Counting itself also takes time, creating a lag time between the plates, and thus limits the number of plates that can be tested at the same time. Using an imaging setup to record many plates simultaneously for the whole duration of the assay would be very useful, but the cost of setup can be prohibitive, depending on the funding situation of the research lab.
To address this, we devised a very simple method that uses smartphones to record avoidance assays. Each phone can record time-lapse videos of up to six assay plates. To provide transmitted light, we use a light emitting diode (LED) light box that can be easily purchased online. Assay plates are placed on an elevated platform, supported by hollow rectangular tunnels, that focus the incoming light, creating contrast. We also provide a Python script that converts the videos into audio video interleave (AVI) files showing 10 s clips of each hourly time point. The videos are then cropped to individual plates and saved in separate files to use for manual counting.
The method provides a low-cost procedure that is also extremely easy to use, using items that are readily available to most people. Here, we describe the method using the well-established lawn avoidance assay against the human pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA14), whose protocol has been previously described2,9. Finally, we also review the considerations and limitations of the imaging method for those that want to apply it to other C. elegans behavior experiments.

Autore in primo piano: un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans  

Un metodo di imaging basato su smartphone per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

Among the many behaviors displayed by C-elegans, pathogenic lawn avoidance is the worm's defense strategy to minimize its exposure to harmful pathogens. In our lab, we use this behavior as a tool to identify genes involved in the proper functioning of the neurons that mediate this behavior. The lawn avoidance behavior is a simple assay, however it develops over many hours.Hence, it is convenient if the assay can be recorded to observe behavior over long time periods. Also, if multiple assays can be recorded at the same time, that's even better. Although there are many imaging solutions described in the literature, even a few modestly priced cameras may be out of reach for labs with limited resources.Also, some may want to try the assay, but do not plan on doing it long term. For such cases, short-term solutions such as this protocol might help. Our amazing protocol offers an easy, low cost way to record worm behavior.We use smartphones to record the assay, then process the video through a Python script that makes it suitable for counting.

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Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay  

Elaborazione video e conteggio manuale per il saggio di evitamento del prato di C. elegans

Identificare le dimensioni di una piastra PA14 contenente i worm dello stadio L4 eseguendo lo script Python extract_frame.py. Quindi aprire il file JPEG in ImageJ. Dal menu, scegli Analizza, quindi Imposta misure.Assicurarsi che la casella Visualizza etichetta sia selezionata e chiudere la finestra. Utilizzando lo strumento linea retta, misurate il diametro di una lastra tracciando una linea attraverso di essa. Quindi scegli Analizza, quindi Misura dal menu.Se il video è in 1080 pixel, ogni piastra sarà larga circa 480 pixel. Immettere queste informazioni nel blocco note da utilizzare in seguito e chiudere la finestra dei risultati. Utilizzando lo strumento multipunto, contrassegna i punti sul lato superiore sinistro di ogni piastra che diventerà l'angolo in alto a sinistra dei video ritagliati.Segnalo in ordine di quando sono state avviate le piastre. Dopo aver creato un punto per tutte le piastre, scegliete Analizza, quindi Misura (Measure) dal menu. Le misurazioni che includono le coordinate X e Y dei punti appariranno nella finestra dei risultati.Per elaborare più video, ripetete il processo in ImageJ con altri file JPEG. Tutte le coordinate X e Y verranno elencate nella stessa finestra dei risultati. Salvare la finestra dei risultati in un file CSV.Il file deve essere salvato nella stessa directory dei file del filmato. Per trovare l'ora di inizio di ogni piatto, riprodurre il filmato sul computer o sul telefono e prendere nota degli orari di inizio di ogni set di lastre posizionate sotto la fotocamera. Aprire i risultati.CSV con le coordinate e aggiungere una colonna iniziale. Per ogni riga corrispondente alle singole targhe, immettere l'ora di inizio appropriata in secondi sotto la colonna iniziale. Salvare il file.Per ritagliare e tagliare i video, esegui il crop_n_trim. script py. Scegli i risultati.CSV. Immettete le dimensioni della piastra e il valore in pixel annotati in precedenza. Lo script leggerà ora ogni riga dei risultati.CSV per trovare il filmato corretto al termine dell'esecuzione dello script. Apparirà una cartella con lo stesso nome del filmato, seguita dall'ora di inizio in cui verranno salvati i video corrispondenti al test. Per il conteggio manuale, aprire ogni file AVI in ImageJ.Contare i vermi visibili all'esterno del prato e quindi calcolare il tasso di occupazione per ogni punto orario. I vermi selvatici N2 hanno progressivamente lasciato il prato batterico e sono rimasti all'esterno come notato nel tasso di occupazione nel tempo. I conteggi effettuati direttamente dalle lastre sono stati confrontati con i conteggi dei vermi ripresi.I conteggi fatti da worm immaginati si sono rivelati altamente accurati. Quando sono state mediate insieme tre prove per ciascun ceppo, i ceppi N2 e NPR1 hanno prodotto rispettivamente un'accuratezza del 99,5% e del 96,2%.

Research

JoVE Journal

Behavior

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...