Name: Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay
Uploaded: 2023-05-19T16:00:00
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The video demonstrates how to process images of PA14 plates containing L4 stage worms using Python and ImageJ. It covers measuring plate dimensions, marking coordinates for cropping videos, saving results, and analyzing worm counts for occupancy rates, highlighting the accuracy of counts from images vs. direct observations.

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Among the many advantages of studying C. elegans, its simple nervous system offers the opportunity to study how changes at the genetic and cellular level impact network function and behavioral output. Despite having a limited number of neurons, C. elegans display a wide range of complex behaviors. One of these is lawn avoidance, in which the bacterivorous nematode responds to a harmful food source by leaving the bacterial lawn. C. elegans avoid lawns of pathogenic bacteria1,2,3, lawns of bacteria that produce toxins or are spiked with toxins1,4, and even RNAi-expressing bacteria whose target gene knockdown is detrimental to the health of the worms4,5. Studies have shown that worms respond to external cues such as metabolites produced by the pathogenic bacteria1,6, or internal cues that indicate that the food is making them sick4,7. These cues are processed through conserved signaling pathways, such as the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the transforming growth factor beta (TGF&#946;) pathway, and require communication between the gut and the nervous system4,6,7,8.
Although the assay is simple, the learned behavior develops over many hours, often overnight. While there are mutants that are incapable of leaving, in which case scoring avoidance at just one time point is sufficient to demonstrate the defect, many mutants do leave eventually but are slower to come out. For these, the movement of the worms needs to be tracked every few hours, which can be difficult to do overnight. Counting itself also takes time, creating a lag time between the plates, and thus limits the number of plates that can be tested at the same time. Using an imaging setup to record many plates simultaneously for the whole duration of the assay would be very useful, but the cost of setup can be prohibitive, depending on the funding situation of the research lab.
To address this, we devised a very simple method that uses smartphones to record avoidance assays. Each phone can record time-lapse videos of up to six assay plates. To provide transmitted light, we use a light emitting diode (LED) light box that can be easily purchased online. Assay plates are placed on an elevated platform, supported by hollow rectangular tunnels, that focus the incoming light, creating contrast. We also provide a Python script that converts the videos into audio video interleave (AVI) files showing 10 s clips of each hourly time point. The videos are then cropped to individual plates and saved in separate files to use for manual counting.
The method provides a low-cost procedure that is also extremely easy to use, using items that are readily available to most people. Here, we describe the method using the well-established lawn avoidance assay against the human pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA14), whose protocol has been previously described2,9. Finally, we also review the considerations and limitations of the imaging method for those that want to apply it to other C. elegans behavior experiments.

저자 스포트라이트: 예쁜꼬마선충(C. elegans) 잔디 회피 분석을 위한 스마트폰 기반 이미징 방법  

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Among the many behaviors displayed by C-elegans, pathogenic lawn avoidance is the worm's defense strategy to minimize its exposure to harmful pathogens. In our lab, we use this behavior as a tool to identify genes involved in the proper functioning of the neurons that mediate this behavior. The lawn avoidance behavior is a simple assay, however it develops over many hours.Hence, it is convenient if the assay can be recorded to observe behavior over long time periods. Also, if multiple assays can be recorded at the same time, that's even better. Although there are many imaging solutions described in the literature, even a few modestly priced cameras may be out of reach for labs with limited resources.Also, some may want to try the assay, but do not plan on doing it long term. For such cases, short-term solutions such as this protocol might help. Our amazing protocol offers an easy, low cost way to record worm behavior.We use smartphones to record the assay, then process the video through a Python script that makes it suitable for counting.

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Python 스크립트 extract_frame.py를 실행하여 L4 스테이지 웜이 포함된 PA14 플레이트의 치수를 식별합니다. 그런 다음 ImageJ에서 JPEG 파일을 엽니다. 메뉴에서 Analyze(분석)를 선택한 다음 Set Measurements(측정 설정)를 선택합니다.표시 레이블 상자가 선택되어 있는지 확인하고 창을 닫습니다. 직선 도구를 사용하여 판을 가로질러 선을 그려 판의 지름을 측정합니다. 그런 다음 메뉴에서 Analyze(분석)를 선택한 다음 Measure(측정)를 선택합니다.비디오가 1080픽셀인 경우 각 플레이트의 너비는 약 480픽셀입니다. 나중에 사용할 수 있도록 메모장에 이 정보를 입력하고 결과 창을 닫습니다. 다점 도구를 사용하여 자른 비디오의 왼쪽 상단 모서리가 될 각 플레이트의 왼쪽 상단에 점을 표시합니다.플레이트가 시작된 순서대로 표시하십시오. 모든 플레이트에 대한 점을 생성한 후 메뉴에서 Analyze(분석)를 선택한 다음 Measure(측정)를 선택합니다. 포인트의 X 및 Y 좌표를 포함한 측정값이 결과 창에 나타납니다.여러 비디오를 처리하려면 ImageJ에서 다른 JPEG 파일과 함께 프로세스를 반복합니다. 모든 X 및 Y 좌표가 동일한 결과 창에 나열됩니다. 결과 창을 CSV 파일로 저장합니다.파일은 동영상 파일과 동일한 디렉터리에 저장해야 합니다. 각 플레이트의 시작 시간을 찾으려면 컴퓨터나 휴대폰에서 동영상을 재생하고 카메라 아래에 놓인 각 플레이트 세트의 시작 시간을 기록해 둡니다. 결과를 엽니다.CSV 파일을 좌표와 함께 만들고 시작 열을 추가합니다. 개별 플레이트에 해당하는 각 행에 대해 시작 열 아래에 적절한 시작 시간(초)을 입력합니다. 파일을 저장합니다.비디오를 자르고 다듬으려면 crop_n_trim 실행하십시오. py 스크립트. 결과를 선택합니다.CSV 파일. 플레이트 치수와 앞에서 기록한 픽셀 값을 입력합니다. 이제 스크립트가 결과의 각 행을 읽습니다.CSV 파일을 사용하여 스크립트 실행이 완료된 후 올바른 동영상 파일을 찾을 수 있습니다. 동영상과 동일한 이름의 폴더가 나타나고 분석에 해당하는 동영상이 저장되는 시작 시간이 표시됩니다. 수동 계산의 경우 ImageJ에서 각 AVI 파일을 엽니다.잔디밭 바깥에 보이는 벌레를 세고 각 시점의 점유율을 계산합니다. 야생형 N2 웜은 점진적으로 박테리아 잔디밭을 떠나 시간이 지남에 따라 점유율에 명시된 대로 외부에 머물렀습니다. 플레이트에서 직접 만든 카운트를 이미지화된 웜의 카운트와 비교했습니다.이미지화 된 웜으로 만든 카운트는 매우 정확한 것으로 판명되었습니다. 각 균주에 대한 3번의 시험을 함께 평균했을 때 N2 및 NPR1 균주는 각각 99.5% 및 96.2%의 정확도를 산출했습니다.

Research

JoVE Journal

Behavior

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...