Name: Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay
Uploaded: 2023-05-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay at JoVE.com

The video demonstrates how to process images of PA14 plates containing L4 stage worms using Python and ImageJ. It covers measuring plate dimensions, marking coordinates for cropping videos, saving results, and analyzing worm counts for occupancy rates, highlighting the accuracy of counts from images vs. direct observations.

video processing and manual counting for c. elegans lawn avoidance assay

Imágenes basadas en teléfonos inteligentes para el ensayo de evitación del césped de C. elegans

Among the many advantages of studying C. elegans, its simple nervous system offers the opportunity to study how changes at the genetic and cellular level impact network function and behavioral output. Despite having a limited number of neurons, C. elegans display a wide range of complex behaviors. One of these is lawn avoidance, in which the bacterivorous nematode responds to a harmful food source by leaving the bacterial lawn. C. elegans avoid lawns of pathogenic bacteria1,2,3, lawns of bacteria that produce toxins or are spiked with toxins1,4, and even RNAi-expressing bacteria whose target gene knockdown is detrimental to the health of the worms4,5. Studies have shown that worms respond to external cues such as metabolites produced by the pathogenic bacteria1,6, or internal cues that indicate that the food is making them sick4,7. These cues are processed through conserved signaling pathways, such as the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the transforming growth factor beta (TGF&#946;) pathway, and require communication between the gut and the nervous system4,6,7,8.
Although the assay is simple, the learned behavior develops over many hours, often overnight. While there are mutants that are incapable of leaving, in which case scoring avoidance at just one time point is sufficient to demonstrate the defect, many mutants do leave eventually but are slower to come out. For these, the movement of the worms needs to be tracked every few hours, which can be difficult to do overnight. Counting itself also takes time, creating a lag time between the plates, and thus limits the number of plates that can be tested at the same time. Using an imaging setup to record many plates simultaneously for the whole duration of the assay would be very useful, but the cost of setup can be prohibitive, depending on the funding situation of the research lab.
To address this, we devised a very simple method that uses smartphones to record avoidance assays. Each phone can record time-lapse videos of up to six assay plates. To provide transmitted light, we use a light emitting diode (LED) light box that can be easily purchased online. Assay plates are placed on an elevated platform, supported by hollow rectangular tunnels, that focus the incoming light, creating contrast. We also provide a Python script that converts the videos into audio video interleave (AVI) files showing 10 s clips of each hourly time point. The videos are then cropped to individual plates and saved in separate files to use for manual counting.
The method provides a low-cost procedure that is also extremely easy to use, using items that are readily available to most people. Here, we describe the method using the well-established lawn avoidance assay against the human pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA14), whose protocol has been previously described2,9. Finally, we also review the considerations and limitations of the imaging method for those that want to apply it to other C. elegans behavior experiments.

Autor destacado: Un método de imágenes basado en teléfonos inteligentes para el ensayo de evitación del césped de C. elegans  

Un método de imagen basado en teléfonos inteligentes para el ensayo de evitación de césped de C. elegans

Among the many behaviors displayed by C-elegans, pathogenic lawn avoidance is the worm's defense strategy to minimize its exposure to harmful pathogens. In our lab, we use this behavior as a tool to identify genes involved in the proper functioning of the neurons that mediate this behavior. The lawn avoidance behavior is a simple assay, however it develops over many hours.Hence, it is convenient if the assay can be recorded to observe behavior over long time periods. Also, if multiple assays can be recorded at the same time, that's even better. Although there are many imaging solutions described in the literature, even a few modestly priced cameras may be out of reach for labs with limited resources.Also, some may want to try the assay, but do not plan on doing it long term. For such cases, short-term solutions such as this protocol might help. Our amazing protocol offers an easy, low cost way to record worm behavior.We use smartphones to record the assay, then process the video through a Python script that makes it suitable for counting.

Watch this Scientific Journal Video about Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay at JoVE.com

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay  

Procesamiento de video y conteo manual para el ensayo de evitación de césped de C. elegans

Identifique las dimensiones de una placa PA14 que contenga los gusanos de etapa L4 ejecutando el script de Python extract_frame.py. Luego abra el archivo JPEG en ImageJ. En el menú, selecciona "Analizar" y, a continuación, "Definir medidas".Asegúrese de que la casilla de etiqueta de visualización esté marcada y cierre la ventana. Con la herramienta de línea recta, mida el diámetro de una placa dibujando una línea a través de ella. A continuación, seleccione Analizar y, a continuación, Medir en el menú.Si el video está en 1080 píxeles, cada placa tendrá aproximadamente 480 píxeles de ancho. Introduzca esta información en el bloc de notas para utilizarla más tarde y cierre la ventana de resultados. Usando la herramienta multipunto, marque puntos en el lado superior izquierdo de cada placa que se convertirá en la esquina superior izquierda de los videos recortados.Márquelo en orden de cuando se iniciaron las placas. Después de crear un punto para todas las placas, elija Analizar y, a continuación, Medir en el menú. Las mediciones que incluyen las coordenadas X e Y de los puntos aparecerán en la ventana de resultados.Para procesar varios vídeos, repita el proceso en ImageJ con otros archivos JPEG. Todas las coordenadas X e Y se enumerarán en la misma ventana de resultados. Guarde la ventana de resultados en un archivo CSV.El archivo debe guardarse en el mismo directorio que los archivos de película. Para encontrar la hora de inicio de cada placa, reproduzca la película en la computadora o en el teléfono y tome nota de las horas de inicio de cada conjunto de placas colocadas debajo de la cámara. Abra los resultados.CSV con las coordenadas y agregue una columna de inicio. Para cada fila correspondiente a placas individuales, introduzca la hora de inicio adecuada en segundos debajo de la columna de inicio. Guarde el archivo.Para recortar y recortar los vídeos, ejecute el crop_n_trim. Guión py. Elige los resultados.CSV. Introduzca las dimensiones de la placa y el valor de píxeles indicado anteriormente. El script ahora leerá cada fila de los resultados.CSV para encontrar el archivo de película correcto después de que el script termine de ejecutarse. Aparecerá una carpeta con el mismo nombre que la película, seguida de la hora de inicio en la que se guardarán los videos correspondientes al ensayo. Para el conteo manual, abra cada archivo AVI en ImageJ.Cuente los gusanos que son visibles fuera del césped y luego calcule la tasa de ocupación para cada punto de tiempo. Los gusanos salvajes tipo N2 abandonaron progresivamente el césped bacteriano y permanecieron afuera como se observa en la tasa de ocupación a lo largo del tiempo. Los recuentos realizados directamente de las placas se compararon con los recuentos de gusanos con imágenes.Los recuentos hechos de gusanos con imágenes resultaron ser altamente precisos. Cuando se promediaron tres ensayos para cada cepa juntos, las cepas N2 y NPR1 produjeron una precisión del 99,5% y 96,2%, respectivamente.

Research

JoVE Journal

Behavior

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...