Name: Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay
Uploaded: 2023-05-19T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay at JoVE.com

The video demonstrates how to process images of PA14 plates containing L4 stage worms using Python and ImageJ. It covers measuring plate dimensions, marking coordinates for cropping videos, saving results, and analyzing worm counts for occupancy rates, highlighting the accuracy of counts from images vs. direct observations.

video processing and manual counting for c. elegans lawn avoidance assay

Smartphone-baserad avbildning för C. elegans Lawn Avoidance Assay

Among the many advantages of studying C. elegans, its simple nervous system offers the opportunity to study how changes at the genetic and cellular level impact network function and behavioral output. Despite having a limited number of neurons, C. elegans display a wide range of complex behaviors. One of these is lawn avoidance, in which the bacterivorous nematode responds to a harmful food source by leaving the bacterial lawn. C. elegans avoid lawns of pathogenic bacteria1,2,3, lawns of bacteria that produce toxins or are spiked with toxins1,4, and even RNAi-expressing bacteria whose target gene knockdown is detrimental to the health of the worms4,5. Studies have shown that worms respond to external cues such as metabolites produced by the pathogenic bacteria1,6, or internal cues that indicate that the food is making them sick4,7. These cues are processed through conserved signaling pathways, such as the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the transforming growth factor beta (TGF&#946;) pathway, and require communication between the gut and the nervous system4,6,7,8.
Although the assay is simple, the learned behavior develops over many hours, often overnight. While there are mutants that are incapable of leaving, in which case scoring avoidance at just one time point is sufficient to demonstrate the defect, many mutants do leave eventually but are slower to come out. For these, the movement of the worms needs to be tracked every few hours, which can be difficult to do overnight. Counting itself also takes time, creating a lag time between the plates, and thus limits the number of plates that can be tested at the same time. Using an imaging setup to record many plates simultaneously for the whole duration of the assay would be very useful, but the cost of setup can be prohibitive, depending on the funding situation of the research lab.
To address this, we devised a very simple method that uses smartphones to record avoidance assays. Each phone can record time-lapse videos of up to six assay plates. To provide transmitted light, we use a light emitting diode (LED) light box that can be easily purchased online. Assay plates are placed on an elevated platform, supported by hollow rectangular tunnels, that focus the incoming light, creating contrast. We also provide a Python script that converts the videos into audio video interleave (AVI) files showing 10 s clips of each hourly time point. The videos are then cropped to individual plates and saved in separate files to use for manual counting.
The method provides a low-cost procedure that is also extremely easy to use, using items that are readily available to most people. Here, we describe the method using the well-established lawn avoidance assay against the human pathogen Pseudomonas aeruginosa (PA14), whose protocol has been previously described2,9. Finally, we also review the considerations and limitations of the imaging method for those that want to apply it to other C. elegans behavior experiments.

Författare Spotlight: En smartphone-baserad avbildningsmetod för C. elegans Lawn Avoidance Assay  

En smartphone-baserad avbildningsmetod för C. elegans Lawn Avoidance Assay

Among the many behaviors displayed by C-elegans, pathogenic lawn avoidance is the worm's defense strategy to minimize its exposure to harmful pathogens. In our lab, we use this behavior as a tool to identify genes involved in the proper functioning of the neurons that mediate this behavior. The lawn avoidance behavior is a simple assay, however it develops over many hours.Hence, it is convenient if the assay can be recorded to observe behavior over long time periods. Also, if multiple assays can be recorded at the same time, that's even better. Although there are many imaging solutions described in the literature, even a few modestly priced cameras may be out of reach for labs with limited resources.Also, some may want to try the assay, but do not plan on doing it long term. For such cases, short-term solutions such as this protocol might help. Our amazing protocol offers an easy, low cost way to record worm behavior.We use smartphones to record the assay, then process the video through a Python script that makes it suitable for counting.

Watch this Scientific Journal Video about Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay at JoVE.com

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay  

Videobearbetning och manuell räkning för C. elegans Lawn Avoidance Assay

Identifiera dimensionerna för en PA14-platta som innehåller L4-stegsmaskarna genom att köra Python-skriptet extract_frame.py. Öppna sedan JPEG-filen i ImageJ. På menyn väljer du Analysera och sedan Ställ in mått.Kontrollera att rutan för visningsetikett är markerad och stäng fönstret. Använd verktyget för rak linje och mät diametern på en platta genom att rita en linje över den. Välj sedan Analysera och sedan Mät från menyn.Om videon är i 1080 pixlar kommer varje platta att vara cirka 480 pixlar bred. Ange den här informationen i anteckningsblocket som ska användas senare och stäng resultatfönstret. Använd flerpunktsverktyget och markera punkter på den övre vänstra sidan av varje platta som blir det övre vänstra hörnet av de beskurna videorna.Markera den i ordning efter när plåtarna startades. När du har skapat en punkt för alla plåtar väljer du Analysera och sedan Mät på menyn. Mätningar inklusive x- och y-koordinaterna för punkterna visas i resultatfönstret.Om du vill bearbeta flera videor upprepar du processen i ImageJ med andra JPEG-filer. Alla X- och Y-koordinater listas i samma resultatfönster. Spara resultatfönstret i en CSV-fil.Filen ska sparas i samma katalog som filmfilerna. För att hitta starttiden för varje platta, spela filmen antingen på datorn eller telefonen och notera starttiderna för varje uppsättning plattor placerade under kameran. Öppna resultaten.CSV-fil med koordinaterna och lägg till en startkolumn. För varje rad som motsvarar enskilda skyltar anger du lämplig starttid i sekunder under startkolumnen. Spara filen.För att beskära och trimma videorna, kör crop_n_trim. py-skript. Välj resultat.csv-fil. Ange plattans mått och pixelvärdet som antecknades tidigare. Skriptet läser nu varje rad med resultaten.CSV-fil för att hitta rätt filmfil när skriptet har körts. En mapp visas med samma namn som filmen, följt av starttiden då videor som motsvarar analysen sparas. För manuell räkning, öppna varje AVI-fil i ImageJ.Räkna maskarna som är synliga utanför gräsmattan och beräkna sedan beläggningsgraden för varje tidpunkt. De vilda N2-maskarna lämnade gradvis bakteriegräsmattan och stannade utanför, vilket noterades i beläggningsgraden över tiden. Räkningarna som gjordes direkt från plattorna jämfördes med räkningar från avbildade maskar.Räkningarna gjorda av avbildade maskar visade sig vara mycket exakta. När tre försök för varje stam medelvärde beräknades tillsammans, gav N2- och NPR1-stammarna 99.5% respektive 96.2% noggrannhet.

Research

JoVE Journal

Behavior

Video Processing and Manual Counting for C. elegans Lawn Avoidance Assay

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...