Name: A2780 Cells Genomic DNA Isolation and Analysis
Uploaded: 2023-04-21T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A2780 Cells Genomic DNA Isolation and Analysis at JoVE.com

The video outlines a detailed protocol for extracting genomic DNA from A2780 cells. It covers the use of lysis buffer, RNase, and proteinase K, followed by phenol-chloroform extraction and precipitation with sodium chloride and ethanol. The process ensures high-quality DNA suitable for analysis of telomere restriction fragments.

a2780 cells genomic dna isolation and analysis

Kwantificering van de telomeerlengte met behulp van niet-radioactieve chemiluminescentiedetectie

Telomeres are the repetitive DNA sequences present at the end of chromosomes. They have tandem repeats of TTAGGG and maintain genome integrity by protecting the chromosome from both fraying and the end replication problem, which means that part of the 3&#39; overhang is unable to be replicated by DNA polymerase1,2. Short telomeres lead to chromosomal abnormalities in cells, due to which cells become permanently arrested in a stage called replicative senescence3. Short telomeres also cause a host of other problems, such as mitochondria dysfunction4,5 and cell dysfunction.
DNA telomeric repeats are lost as and when the cell divides, with an average loss of 25 to 200 bp per year6, resulting in cellular senescence after a certain number of divisions6. Aging is associated with a higher frequency of comorbidities, which is marked by a shortening in telomere length7. Telomere restriction fragment (TRF) analysis, as described by Mender, is a very expensive method8. Because of this, it is not implemented while quantifying telomere length in most studies.
Presently, the majority of epidemiological studies employ quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based measurements of telomere length. However, the qPCR-based method is a relative measurement method, as it measures the ratio between telomeres and single-copy gene amplification products, and not absolute telomere length. Telomere length measurement using the TRF protocol is the gold standard method, as it can measure telomere length distribution in the sample and measurements can be expressed in absolute values in kilobases (kb). However, its use is limited because it is cumbersome, labor-intensive, and costly. Here, we present an optimized protocol for telomere length measurement using chemiluminescence-based TRFs.
TRF analysis includes seven major steps: 1) culturing of cells for genomic DNA extraction, 2) genomic DNA extraction using the phenol:chloroform:isoamylalcohol (P:C:I) method, 3) restriction digestion of genomic DNA, 4) agarose gel electrophoresis, 5) Southern blotting of the restriction digestion DNA fragment, 6) hybridization and detection via chemiluminescence-the immobilized telomere probe is visualized by a highly sensitive chemiluminescent substrate for alkaline phosphatase, disodium 2-chloro-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]decan])-4-yl]-1-phenyl phosphate (CDP-Star)-and 7) analysis for obtaining mean telomere length and range information from these telomeric smears.

Auteur in de schijnwerpers: optimalisatie van de prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest  

Optimalisatie van prestatieparameters van de TAGGG-telomeerlengtetest

The scope of our research involves measuring telomere length differences across various study groups. The questions we are trying to answer revolve around diseases of physiological conditions and how they may affect telomere length and vice versa. The technology is currently used to advance research in the field of telomere length biology are nanopore sequencing and more recently CRISPR Cas based measurement.Current experimental challenges are accurately measuring absolute telomere length and the changes in it. The same sample could give varying results when different methods of measuring telomere length are used. The research gap we address is the lack of a standard method to measure telomere length.Telomere restriction fragment analysis or TRF, is still the standard against which all new techniques are evaluated. Also, our optimized protocols helps in processing a higher number of samples with limited resources. Our findings will help advance research in the field of telomere length biologic by providing a reliable and relatively economical way to compare newer methods to the gold standard, which is TRF.Our laboratory will focus on the effects of small molecule inhibitors on telomere length. We will also study the impact that lifestyle diseases and telomere length have on on each other.

Watch this Scientific Journal Video about A2780 Cells Genomic DNA Isolation and Analysis at JoVE.com

A2780 Cells Genomic DNA Isolation and Analysis  

A2780 Cellen Genomische DNA-isolatie en -analyse

Begin met het toevoegen van 500 microliter van de lysisbuffer aan de eerder verkregen A2780-celpellet en meng voorzichtig met behulp van een gesneden punt met een minimale openingsdiameter van twee millimeter. Voeg 20 microgram per milliliter vers bereide RNase toe en meng door zachte inversie. Incubeer het op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Voeg aan het einde van de incubatie proteïnase K toe tot een eindconcentratie van 100 microgram per milliliter en keer 10 keer voorzichtig om. Incubeer opnieuw bij 55 graden Celsius gedurende een uur en keer de buis elke 10 minuten om. Pipetteer 500 microliter fenol:chloroform:isoamylalcoholreagens in de buis en keer de buis ongeveer 20 keer voorzichtig om.Centrifugeer het op 9, 391 G gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Pipetteer de bovenste waterige viskeuze laag in een nieuwe buis. Voeg een gelijk volume chloroform toe en meng door zachte inversie.Nadat u de buis eenmaal hebt gecentrifugeerd, verzamelt u de waterige laag. Voeg een geschikte hoeveelheid van vijf molair natriumchloride toe aan de buis om de concentratie met 0,2 mol te verhogen. Voeg twee volumes 100% ethanol toe aan de buis en keer deze 20 keer voorzichtig om.Centrifugeer op 15, 871 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg na het weggooien van het supernatant 500 microliter 70% ethanol toe. Centrifugeer opnieuw onder dezelfde toestand en gooi vervolgens het supernatant weg.Zodra de pellet aan de lucht is gedroogd, voegt u 50 microliter steriel nucleasevrij water toe en laat u het rehydrateren. Meng vervolgens het DNA door te pipetteren met behulp van de gesneden punt. Gebruik UV-spectrofotometrie om de concentratie van DNA te meten.Na het verteren van het DNA, scheid het met 0,8% agarose. Dompel de agarosegel gedurende 10 minuten onder in 0,25 molaire zoutzuuroplossing bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Spoel de gel vervolgens twee keer af met gedestilleerd water.Om het DNA te denatureren, dompelt u de gel onder in een oplossing van natriumhydroxide en natriumchloride. Spoel de gel vervolgens twee keer af met gedestilleerd water. Om het DNA te neutraliseren zoals aangetoond, dompelt u de gel onder in een oplossing van 0,5 molair zoutzuur en drie molair natriumchloride bij pH zeven.Het genomische DNA van de extractor vertoonde een goede integriteit, wat wijst op het gebruik ervan voor verdere downstream-verwerking van telomeerrestrictiefragmenten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A2780 Cells Genomic DNA Isolation and Analysis

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...