Name: A2780 Cells Genomic DNA Isolation and Analysis
Uploaded: 2023-04-21T13:20:00
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The video outlines a detailed protocol for extracting genomic DNA from A2780 cells. It covers the use of lysis buffer, RNase, and proteinase K, followed by phenol-chloroform extraction and precipitation with sodium chloride and ethanol. The process ensures high-quality DNA suitable for analysis of telomere restriction fragments.

a2780 cells genomic dna isolation and analysis

Quantificazione della lunghezza dei telomeri mediante rilevamento a chemiluminescenza non radioattiva

Telomeres are the repetitive DNA sequences present at the end of chromosomes. They have tandem repeats of TTAGGG and maintain genome integrity by protecting the chromosome from both fraying and the end replication problem, which means that part of the 3&#39; overhang is unable to be replicated by DNA polymerase1,2. Short telomeres lead to chromosomal abnormalities in cells, due to which cells become permanently arrested in a stage called replicative senescence3. Short telomeres also cause a host of other problems, such as mitochondria dysfunction4,5 and cell dysfunction.
DNA telomeric repeats are lost as and when the cell divides, with an average loss of 25 to 200 bp per year6, resulting in cellular senescence after a certain number of divisions6. Aging is associated with a higher frequency of comorbidities, which is marked by a shortening in telomere length7. Telomere restriction fragment (TRF) analysis, as described by Mender, is a very expensive method8. Because of this, it is not implemented while quantifying telomere length in most studies.
Presently, the majority of epidemiological studies employ quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based measurements of telomere length. However, the qPCR-based method is a relative measurement method, as it measures the ratio between telomeres and single-copy gene amplification products, and not absolute telomere length. Telomere length measurement using the TRF protocol is the gold standard method, as it can measure telomere length distribution in the sample and measurements can be expressed in absolute values in kilobases (kb). However, its use is limited because it is cumbersome, labor-intensive, and costly. Here, we present an optimized protocol for telomere length measurement using chemiluminescence-based TRFs.
TRF analysis includes seven major steps: 1) culturing of cells for genomic DNA extraction, 2) genomic DNA extraction using the phenol:chloroform:isoamylalcohol (P:C:I) method, 3) restriction digestion of genomic DNA, 4) agarose gel electrophoresis, 5) Southern blotting of the restriction digestion DNA fragment, 6) hybridization and detection via chemiluminescence-the immobilized telomere probe is visualized by a highly sensitive chemiluminescent substrate for alkaline phosphatase, disodium 2-chloro-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]decan])-4-yl]-1-phenyl phosphate (CDP-Star)-and 7) analysis for obtaining mean telomere length and range information from these telomeric smears.

Autore in primo piano: Ottimizzazione dei parametri prestazionali del saggio della lunghezza dei telomeri TAGGG  

Ottimizzazione dei parametri prestazionali del saggio di lunghezza dei telomeri TAGGG

The scope of our research involves measuring telomere length differences across various study groups. The questions we are trying to answer revolve around diseases of physiological conditions and how they may affect telomere length and vice versa. The technology is currently used to advance research in the field of telomere length biology are nanopore sequencing and more recently CRISPR Cas based measurement.Current experimental challenges are accurately measuring absolute telomere length and the changes in it. The same sample could give varying results when different methods of measuring telomere length are used. The research gap we address is the lack of a standard method to measure telomere length.Telomere restriction fragment analysis or TRF, is still the standard against which all new techniques are evaluated. Also, our optimized protocols helps in processing a higher number of samples with limited resources. Our findings will help advance research in the field of telomere length biologic by providing a reliable and relatively economical way to compare newer methods to the gold standard, which is TRF.Our laboratory will focus on the effects of small molecule inhibitors on telomere length. We will also study the impact that lifestyle diseases and telomere length have on on each other.

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A2780 Cells Genomic DNA Isolation and Analysis  

A2780 Isolamento e analisi del DNA genomico delle cellule A2780

Iniziare aggiungendo 500 microlitri di tampone di lisi al pellet di cella A2780 precedentemente ottenuto e mescolare delicatamente utilizzando una punta tagliata con un diametro minimo di apertura di due millimetri. Aggiungere 20 microgrammi per millilitro di RNasi appena preparata e mescolare per inversione delicata. Incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Alla fine dell'incubazione, aggiungere la proteinasi K a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro e invertire delicatamente 10 volte. Incubare nuovamente a 55 gradi Celsius per un'ora invertendo il tubo ogni 10 minuti. Pipettare 500 microlitri di reagente fenolo:cloroformio:alcool isoamilico nel tubo e capovolgere delicatamente il tubo circa 20 volte.Centrifugare a 9, 391 G per 15 minuti a temperatura ambiente. Pipettare lo strato viscoso acquoso superiore in un nuovo tubo. Aggiungere un volume uguale di cloroformio e mescolare per inversione delicata.Dopo aver centrifugato il tubo una volta, raccogliere lo strato acquoso. Aggiungere una quantità appropriata di cloruro di sodio cinque molari nel tubo per aumentare la concentrazione di 0,2 moli. Aggiungere due volumi di etanolo al 100% nel tubo e capovolgerlo delicatamente 20 volte.Centrifugare a 15, 871 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70%. Centrifugare di nuovo nelle stesse condizioni e quindi eliminare il surnatante.Una volta asciugato il pellet all'aria, aggiungere 50 microlitri di acqua sterile priva di nucleasi e lasciarlo reidratare. Quindi mescolare il DNA mediante pipettaggio usando la punta tagliata. Utilizzare la spettrofotometria UV per misurare la concentrazione di DNA.Dopo aver digerito il DNA, separarlo usando lo 0,8% di agarosio. Immergere il gel di agarosio in una soluzione di acido cloridrico da 0,25 molari per 10 minuti a temperatura ambiente con delicata agitazione. Quindi sciacquare il gel due volte con acqua distillata.Per denaturare il DNA, immergere il gel in una soluzione di idrossido di sodio e cloruro di sodio. Quindi sciacquare il gel due volte con acqua distillata. Per neutralizzare il DNA come dimostrato, immergere il gel in una soluzione di acido cloridrico 0,5 molare e cloruro di sodio tre molari a pH sette.Il DNA genomico dell'estrattore ha mostrato una buona integrità indicando il suo uso per l'ulteriore elaborazione a valle dei frammenti di restrizione dei telomeri.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A2780 Cells Genomic DNA Isolation and Analysis

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...