首先,取一瓶培养的成纤维细胞,在适合hiPSC培养的10厘米细胞培养板上涂上每块板4毫升的冷包衣溶液,并将板在37摄氏度下孵育一小时。之后,从成纤维细胞中取出培养基,并用每瓶四毫升预热的PBS洗涤它们。吸出PBS并将成纤维细胞与每个烧瓶的4毫升胰蛋白酶-EDTA相关联,方法是在37摄氏度下孵育5至7分钟。
使用相衬显微镜监测细胞分离,如果需要,轻敲烧瓶的侧面以将细胞从塑料表面上分离。将分离的细胞转移到50毫升锥形管中,并用6毫升预热的成纤维细胞培养基洗涤空烧瓶。收集并汇集锥形管中的剩余细胞。
然后将细胞在200摄氏度下以200g离心5分钟。吸出上清液并将细胞沉淀重新悬浮在三毫升新鲜的预热PBS中。计数细胞,将1.5乘以10转移到第六个成纤维细胞中,并用PBS填充至5毫米标记。
将试管在 200 摄氏度下以 20 g 离心五分钟。弃去上清液,将细胞沉淀重新悬浮在五毫升电穿孔培养基中,然后再次离心。同时,从包被的10厘米细胞培养板中吸出包衣溶液,并加入7毫升预热的成纤维细胞培养基。
在离心结束时,弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮在电穿孔培养基中,浓度为1.5乘以10至250微升中的第六个细胞。将 250 微升细胞悬液转移到间隙距离为 4 毫米的电穿孔比色皿中。接下来,通过将每个质粒的4微克添加到总体积为50微升的电穿孔培养基中来制备血浆转染混合物。
将转染混合物转移到比色皿中,轻弹轻轻混合,然后以 280 伏的一个脉冲电穿孔。最后,将150微升电穿孔成纤维细胞转移到制备的10厘米细胞培养板中。向各个方向搅拌板三次以分布细胞,并孵育过夜。
成纤维细胞以长而纺锤状的表型存在,大小为150至300纳米。重编程后,出现具有50微米小hiPSC的菌落,显示出明显的边界。hiPSC的特点是高核体比和增加的增殖速率。