Til at begynde med skal du tage en kolbe af dyrkede fibroblastceller, belægge en 10 centimeter cellekulturplade, der er egnet til hiPSC-kultur med fire ml kold belægningsopløsning pr. Plade og inkubere pladen i en time ved 37 grader Celsius. Fjern derefter mediet fra fibroblasterne og vask dem med fire ml forvarmet PBS pr. Kolbe. Opsug PBS og associer fibroblasterne med fire milliliter trypsin-EDTA pr. kolbe ved at inkubere i fem til syv minutter ved 37 grader Celsius.
Overvåg cellefrigørelse ved hjælp af et fasekontrastmikroskop, og bank om nødvendigt mod siden af kolben for at løsne cellerne fra plastoverfladen. Overfør de løsrevne celler til et 50 ml konisk rør og vask de tomme kolber med seks ml forvarmet fibroblastmedium. Saml og saml de resterende celler i det koniske rør.
Derefter centrifugeres cellerne ved 200 g i fem minutter ved 20 grader Celsius. Supernatanten suges op, og cellepelletsen opslæmmes igen i tre ml frisk, forvarmet PBS. Tæl cellerne, overfør 1,5 gange 10 til de sjette fibroblaster i et nyt konisk rør og fyld op med PBS til fem millimeter-mærket.
Centrifuger røret ved 200 g i fem minutter ved 20 grader Celsius. Supernatanten kasseres, cellepelletsen opslæmmes igen i fem ml elektroporationsmedium, og centrifugeres igen. I mellemtiden aspireres belægningsopløsningen fra den belagte 10 centimeter cellekulturplade og tilsættes syv ml forvarmet fibroblastmedium.
Ved centrifugeringens afslutning kasseres supernatanten, og cellepelletten opslæmmes igen i elektroporationsmedium med en koncentration på 1,5 gange 10 til de sjette celler i 250 mikroliter. Overfør 250 mikroliter cellesuspension til en elektroporationskuvette med en afstand på fire millimeter. Derefter fremstilles en plasmatransfektionsblanding ved at tilsætte fire mikrogram af hvert plasmid til et samlet volumen på 50 mikroliter elektroporationsmedium.
Overfør transfektionsblandingen til kuvetten, bland forsigtigt ved at svirpe og elektroporat med en puls ved 280 volt. Overfør til sidst 150 mikroliter af de elektroporerede fibroblaster til den forberedte 10 centimeter cellekulturplade. Omrør pladen tre gange i alle retninger for at fordele cellerne og inkuber natten over.
Fibroblaster til stede i en lang, spindellignende fænotype, størrelsen på 150 til 300 nanometer. Efter omprogrammering forekommer kolonier med 50 mikrometer små hiPSC'er, der viser forskellige grænser. HiPSC'erne kendetegnes ved et højt kerne til kropsforhold og øget spredningshastighed.