Neem om te beginnen een kolf met gekweekte fibroblastcellen, bedek een celkweekplaat van 10 centimeter die geschikt is voor hiPSC-cultuur met vier milliliter koude coatingoplossing per plaat en incuber de plaat gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Verwijder daarna de media uit de fibroblasten en was ze met vier milliliter voorverwarmde PBS per kolf. Zuig de PBS op en associeer de fibroblasten met vier milliliter Trypsine-EDTA per kolf door gedurende vijf tot zeven minuten te broeden bij 37 graden Celsius.
Controleer de celloslating met behulp van een fasecontrastmicroscoop en tik indien nodig tegen de zijkant van de kolf om de cellen los te maken van het plastic oppervlak. Breng de losgemaakte cellen over in een conische buis van 50 milliliter en was de lege kolven met zes milliliter voorverwarmd fibroblastmedium. Verzamel en pool de resterende cellen in de conische buis.
Centrifugeer vervolgens de cellen op 200 g gedurende vijf minuten bij 20 graden Celsius. Zuig het supernatant op en suspensie de celkorrel opnieuw in drie milliliter verse, voorverwarmde PBS. Tel de cellen, breng 1,5 keer 10 tot de zesde fibroblasten over in een nieuwe conische buis en vul met PBS tot de vijf millimeter markering.
Centrifugeer de buis op 200 g gedurende vijf minuten bij 20 graden Celsius. Gooi het supernatant weg, suspensie de celpellet opnieuw in vijf milliliter elektroporatiemedium en centrifugeer opnieuw. Zuig ondertussen de coatingoplossing op van de gecoate celkweekplaat van 10 centimeter en voeg zeven milliliter voorverwarmd fibroblastmedium toe.
Aan het einde van de centrifugatie gooit u het supernatant weg en suspensieert u de celpellet opnieuw in elektroporatiemedium met een concentratie van 1,5 maal 10 tot de zesde cel in 250 microliter. Breng de 250 microliter celsuspensie over naar een elektroporatiecuvet met een afstand van vier millimeter. Bereid vervolgens een plasmatransfectiemengsel door vier microgram van elk plasmide toe te voegen aan een totaal volume van 50 microliter elektroporatiemedium.
Breng het transfectiemengsel over in de cuvette, meng voorzichtig door te vegen en elektroporate met één puls op 280 volt. Breng ten slotte 150 microliter van de geëlektroperde fibroblasten over naar de voorbereide celkweekplaat van 10 centimeter. Roer de plaat driemaal in alle richtingen om de cellen te verdelen en incuber 's nachts.
Fibroblasten aanwezig in een lang, spindelachtig fenotype, ter grootte van 150 tot 300 nanometer. Na herprogrammering ontstaan kolonies met 50 micrometer kleine hiPSC's met duidelijke grenzen. De hiPSC's onderscheiden zich door een hoge verhouding tussen kernen en lichaam en een verhoogde proliferatiesnelheid.