For å begynne, ta en kolbe med dyrkede fibroblastceller, belegg en 10-centimeter cellekulturplate egnet for hiPSC-kultur med fire milliliter kaldbeleggsløsning per plate, og inkuber platen i en time ved 37 grader Celsius. Fjern deretter mediet fra fibroblastene og vask dem med fire milliliter forvarmet PBS per kolbe. Aspirer PBS og assosiere fibroblastene med fire milliliter Trypsin-EDTA per kolbe ved å inkubere i fem til syv minutter ved 37 grader Celsius.
Overvåk celleavløsning ved hjelp av et fasekontrastmikroskop, og trykk om nødvendig mot siden av kolben for å løsne cellene fra plastoverflaten. Overfør de frittliggende cellene til et 50 milliliter konisk rør og vask de tomme kolbene med seks milliliter forvarmet fibroblastmedium. Samle og samle de resterende cellene i det koniske røret.
Deretter sentrifugerer cellene ved 200 g i fem minutter ved 20 grader Celsius. Aspirer supernatanten og suspender cellepelleten i tre milliliter frisk, forvarmet PBS. Telle cellene, overfør 1,5 ganger 10 til de sjette fibroblastene til et nytt konisk rør og fyll opp med PBS til fem millimetermerket.
Sentrifuge røret ved 200 g i fem minutter ved 20 grader Celsius. Kast supernatanten, suspender cellepelleten på nytt i fem milliliter elektroporasjonsmedium og sentrifuge igjen. I mellomtiden aspirerer du beleggløsningen fra den belagte 10-centimeter cellekulturplaten og tilsett syv milliliter forvarmet fibroblastmedium.
Ved slutten av sentrifugeringen kastes supernatanten og suspenderer cellepelleten på nytt i elektroporasjonsmedium med en konsentrasjon på 1,5 ganger 10 til den sjette cellen i 250 mikroliter. Overfør 250 mikroliters celleoppheng til en elektroporasjonskuvette med fire millimeter avstand. Deretter fremstilles en plasmatransfeksjonsblanding ved å tilsette fire mikrogram av hvert plasmid til et totalt volum på 50 mikroliter elektroporasjonsmedium.
Overfør transfeksjonsblandingen til kyvetten, bland forsiktig ved å flikke, og elektroporer med en puls ved 280 volt. Til slutt overfører 150 mikroliter av de elektroporerte fibroblastene til den fremstilte 10-centimeter cellekulturplaten. Agiter platen tre ganger i alle retninger for å fordele cellene, og inkuber over natten.
Fibroblaster tilstede i en lang, spindellignende fenotype, størrelsen på 150 til 300 nanometer. Etter omprogrammering oppstår kolonier med 50 mikrometer små hiPSCer som viser tydelige grenser. HiPSCene er preget av et høyt kjerneforhold mellom og kropp og økt spredningshastighet.
