Para comenzar, tome un matraz de células de fibroblastos cultivadas, cubra una placa de cultivo celular de 10 centímetros adecuada para el cultivo de hiPSC con cuatro mililitros de solución de recubrimiento frío por placa e incube la placa durante una hora a 37 grados centígrados. Después, retire los medios de los fibroblastos y lávelos con cuatro mililitros de PBS precalentado por matraz. Aspirar el PBS y asociar los fibroblastos con cuatro mililitros de tripsina-EDTA por matraz incubando durante cinco a siete minutos a 37 grados centígrados.
Controle el desprendimiento celular con un microscopio de contraste de fase y, si es necesario, golpee contra el costado del matraz para separar las células de la superficie plástica. Transfiera las células desprendidas a un tubo cónico de 50 mililitros y lave los matraces vacíos con seis mililitros de medio de fibroblastos precalentado. Recoja y agrupe las células restantes en el tubo cónico.
Luego centrifugar las células a 200 g durante cinco minutos a 20 grados centígrados. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en tres mililitros de PBS fresco y precalentado. Cuente las células, transfiera 1.5 veces 10 al sexto fibroblastos a un nuevo tubo cónico y llénelo con PBS hasta la marca de cinco milímetros.
Centrifugar el tubo a 200 g durante cinco minutos a 20 grados centígrados. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de medio de electroporación y centrifugar nuevamente. Mientras tanto, aspire la solución de recubrimiento de la placa de cultivo celular recubierta de 10 centímetros y agregue siete mililitros de medio de fibroblastos precalentado.
Al final de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en medio de electroporación con una concentración de 1,5 veces 10 a la sexta celda en 250 microlitros. Transfiera la suspensión de celda de 250 microlitros a una cubeta de electroporación con una distancia de espacio de cuatro milímetros. A continuación, prepare una mezcla de transfección de plasma agregando cuatro microgramos de cada plásmido a un volumen total de 50 microlitros de medio de electroporación.
Transfiera la mezcla de transfección a la cubeta, mezcle suavemente moviendo y electropórela con un pulso a 280 voltios. Finalmente, transfiera 150 microlitros de los fibroblastos electroporados a la placa de cultivo celular de 10 centímetros preparada. Agite la placa tres veces en todas las direcciones para distribuir las células e incube durante la noche.
Los fibroblastos se presentan en un fenotipo largo, en forma de huso, del tamaño de 150 a 300 nanómetros. Después de la reprogramación, se producen colonias con hiPSC pequeñas de 50 micrómetros que muestran bordes distintos. Las hiPSCs se distinguen por una alta relación núcleo/cuerpo y una mayor tasa de proliferación.
