Börja med att ta en kolv med odlade fibroblastceller, belägg en 10-centimeter cellodlingsplatta lämplig för hiPSC-odling med fyra milliliter kall beläggningslösning per platta och inkubera plattan i en timme vid 37 grader Celsius. Ta sedan bort mediet från fibroblasterna och tvätta dem med fyra milliliter förvärmd PBS per kolv. Aspirera PBS och associera fibroblasterna med fyra milliliter trypsin-EDTA per kolv genom att inkubera i fem till sju minuter vid 37 grader Celsius.
Övervaka cellavlossningen med hjälp av ett faskontrastmikroskop och knacka vid behov mot kolvens sida för att lossa cellerna från plastytan. Överför de fristående cellerna till ett 50 ml koniskt rör och tvätta de tomma kolvarna med sex ml förvärmt fibroblastmedium. Samla och slå samman de återstående cellerna i det koniska röret.
Centrifugera sedan cellerna vid 200 g i fem minuter vid 20 grader Celsius. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i tre milliliter färsk, förvärmd PBS. Räkna cellerna, överför 1,5 gånger 10 till de sjätte fibroblasterna till ett nytt koniskt rör och fyll på med PBS till fem millimeter.
Centrifugera röret vid 200 g i fem minuter vid 20 grader Celsius. Kassera supernatanten, suspendera cellpelleten igen i fem milliliter elektroporeringsmedium och centrifugera igen. Under tiden aspirerar beläggningslösningen från den belagda 10-centimeter cellodlingsplattan och tillsätt sju milliliter förvärmt fibroblastmedium.
Vid slutet av centrifugeringen, kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i elektroporeringsmedium med en koncentration av 1,5 gånger 10 till sjätte cellerna i 250 mikroliter. Överför 250 mikroliter cellsuspensionen till en elektroporeringskyvett med ett mellanrum på fyra millimeter. Därefter bereds en plasmatransfektionsblandning genom tillsats av fyra mikrogram av varje plasmid till en total volym av 50 mikroliter elektroporeringsmedium.
Överför transfektionsblandningen till kyvetten, blanda försiktigt genom att snärta och elektroporera med en puls vid 280 volt. Slutligen överför 150 mikroliter av de elektroporerade fibroblasterna till den beredda 10-centimeter cellodlingsplattan. Skaka plattan tre gånger i alla riktningar för att fördela cellerna och inkubera över natten.
Fibroblaster närvarande i en lång, spindelliknande fenotyp, storleken 150 till 300 nanometer. Efter omprogrammering uppstår kolonier med 50 mikrometer små hiPSC som visar distinkta gränser. HiPSC kännetecknas av ett högt förhållande mellan kärnor och kropp och ökad spridningshastighet.