Başlamak için, kültürlü fibroblast hücrelerinden bir şişe alın, plaka başına dört mililitre soğuk kaplama çözeltisi ile hiPSC kültürüne uygun 10 santimetrelik bir hücre kültürü plakasını kaplayın ve plakayı 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, ortamı fibroblastlardan çıkarın ve şişe başına dört mililitre önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve fibroblastları 37 santigrat derecede beş ila yedi dakika inkübe ederek şişe başına dört mililitre Tripsin-EDTA ile ilişkilendirin.
Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak hücre ayrılmasını izleyin ve gerekirse, hücreleri plastik yüzeyden ayırmak için şişenin yan tarafına dokunun. Ayrılan hücreleri 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve boş şişeleri altı mililitre önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yıkayın. Kalan hücreleri konik tüpte toplayın ve bir araya getirin.
Daha sonra hücreleri 20 santigrat derecede beş dakika boyunca 200 g'da santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini üç mililitre taze, önceden ısıtılmış PBS'de yeniden askıya alın. Hücreleri sayın, altıncı fibroblastlara 1.5 kez 10 kez yeni bir konik tüpe aktarın ve PBS ile beş milimetre işaretine kadar doldurun.
Tüpü 20 santigrat derecede beş dakika boyunca 200 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücre peletini beş mililitre elektroporasyon ortamında tekrar askıya alın ve tekrar santrifüj yapın. Bu arada, kaplama çözeltisini kaplanmış 10 santimetrelik hücre kültürü plakasından aspire edin ve yedi mililitre önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ekleyin.
Santrifüjlemenin sonunda, süpernatantı atın ve hücre peletini elektroporasyon ortamında 250 mikrolitrede altıncı hücrelere 1.5 kat 10 konsantrasyonda yeniden askıya alın. 250 mikrolitrelik hücre süspansiyonunu dört milimetre boşluk mesafesine sahip bir elektroporasyon küvetine aktarın. Daha sonra, toplam 50 mikrolitre elektroporasyon ortamına her plazmidin dört mikrogramını ekleyerek bir plazma transfeksiyon karışımı hazırlayın.
Transfeksiyon karışımını küvete aktarın, hafifçe hafifçe karıştırın ve 280 voltta bir darbeyle elektroporat. Son olarak, elektroporate fibroblastların 150 mikrolitresini hazırlanan 10 santimetrelik hücre kültürü plakasına aktarın. Hücreleri dağıtmak için plakayı her yöne üç kez çalkalayın ve gece boyunca inkübe edin.
Fibroblastlar, 150 ila 300 nanometre büyüklüğünde uzun, iğ benzeri bir fenotipte bulunur. Yeniden programlamadan sonra, 50 mikrometre küçük hiPSC'lere sahip koloniler farklı sınırlar gösterir. HiPSC'ler yüksek çekirdek-vücut oranı ve artmış proliferasyon hızı ile ayırt edilir.