Neem om te beginnen de plaat van geëlektropoeerde fibroblasten en observeer de vorming van hiPSC-kolonies onder een 10x tot 20x objectieve fasecontrastmicroscoop. De hiPSC-kolonies met een diameter van 300 micrometer, duidelijke randen en een hoge verhouding tussen kernen en lichaam zijn geschikt om te plukken. Bedek voor het plukken de putten van een 96-putplaat die geschikt is voor hiPSC-cultuur met 100 microliter coatingoplossing.
En incuberen gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Markeer tijdens de incubatie de interessante kolonies op de bodem van de celkweekschaal met een pen. Verwijder voor de laatste bereiding van de 96-putplaat de coatingoplossing en voeg 100 microliter voorverwarmd hiPSC-kweekmedium met 10 micromol ROCK-remmer Y-27632 toe aan elke put.
Was vervolgens de cellen met voorverwarmde PBS en voeg vers voorverwarmd hiPSC-kweekmedium toe met 10 micromol ROCK-remmer Y-27632 voordat u kiest om dode cellen te verwijderen. Pluk de hiPSC-kolonies met behulp van een meetnaald en verdeel de kolonies in kleine stukjes door een raster in elke kolonie te tekenen. Gebruik daarna een fasecontrastmicroscoop om te controleren of de kolonies met succes in stukken zijn verdeeld.
Breng ten slotte de kolonies over met een pipet van 100 microliter naar de voorbereide 96-putplaat en houd de pipet rechtop boven de kolonie. Laat de cellen zich een nacht hechten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide zonder verstoring. Vervang de volgende dag het medium door 200 microliter vers hiPSC-kweekmedium om de ROCK-remmer Y-27632 te verwijderen en plaats de platen terug in de incubator.
Bewaak de 96-putplaat en markeer de putten met succesvol geplukte klonen. De gemarkeerde klonen kunnen op dit punt worden uitgebreid en ingevroren. Fasecontrastbeelden hebben met succes hiPSC-kolonies geherprogrammeerd, geselecteerde hiPSC's, spontaan gedifferentieerde kolonies, niet-hiPSC-kolonies en een te dichte hiPSC-cultuur worden gepresenteerd.