Per iniziare, prendi la piastra di fibroblasti elettroporati e osserva la formazione di colonie hiPSC sotto un microscopio a contrasto di fase oggettiva da 10x a 20x. Le colonie hiPSC con diametro di 300 micrometri, bordi distinti e un elevato rapporto nuclei/corpo sono adatte per la raccolta. Prima della raccolta, rivestire i pozzetti di una piastra da 96 pozzetti adatta alla coltura hiPSC con 100 microlitri di soluzione di rivestimento.
E incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Durante l'incubazione, contrassegnare le colonie di interesse nella parte inferiore del piatto di coltura cellulare con una penna. Per la preparazione finale della piastra a 96 pozzetti, rimuovere la soluzione di rivestimento e aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura hiPSC preriscaldato, contenente 10 micromoli di inibitore ROCK Y-27632 a ciascun pozzetto.
Quindi, lavare le cellule con PBS preriscaldato e aggiungere terreno di coltura hiPSC fresco preriscaldato contenente 10 micromoli di inibitore ROCK Y-27632 prima di raccogliere per rimuovere le cellule morte. Scegli le colonie hiPSC usando un ago di misura e dividi le colonie in piccoli pezzi disegnando una griglia in ogni colonia. Successivamente, utilizzare un microscopio a contrasto di fase per verificare che le colonie siano divise con successo in pezzi.
Infine, trasferire le colonie con una pipetta da 100 microlitri sulla piastra da 96 pozzetti preparata, tenendo la pipetta in posizione verticale sopra la colonia. Lasciare che le cellule si attacchino durante la notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica senza disturbi. Il giorno seguente, sostituire il terreno con 200 microlitri di terreno di coltura fresco hiPSC per rimuovere l'inibitore ROCK Y-27632 e riposizionare le piastre nell'incubatore.
Monitora la piastra dei 96 pozzetti e contrassegna i pozzetti con cloni selezionati con successo. I cloni contrassegnati possono essere espansi e congelati a questo punto. Le immagini a contrasto di fase hanno riprogrammato con successo colonie hiPSC, hiPSC selezionate, colonie spontaneamente differenziate, colonie non hiPSC e una coltura hiPSC troppo densa.
