먼저 전기천공된 섬유아세포 플레이트를 채취하여 10x에서 20x 대물렌즈 위상차 현미경으로 hiPSC 콜로니의 형성을 관찰합니다. 직경이 300마이크로미터이고 경계가 뚜렷하며 핵 대 체의 비율이 높은 hiPSC 콜로니가 채취에 적합합니다. 채취하기 전에 hiPSC 배양에 적합한 96웰 플레이트의 웰을 100마이크로리터의 코팅 용액으로 코팅합니다.
그리고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 세포 배양 접시 바닥에 관심있는 콜로니를 펜으로 표시하십시오. 96 웰 플레이트의 최종 준비를 위해, 코팅 용액을 제거하고, 10 마이크로몰의 ROCK 억제제 Y-27632를 함유하는 100 마이크로리터의 예열된 hiPSC 배양 배지를 각 웰에 첨가한다.
다음으로, 예열된 PBS로 세포를 세척하고, 죽은 세포를 제거하기 위해 선택하기 전에 10마이크로몰의 ROCK 억제제 Y-27632를 함유하는 신선한 예열 hiPSC 배양 배지를 추가합니다. 게이지 바늘을 사용하여 hiPSC 콜로니를 선택하고 각 콜로니에 그리드를 그려 콜로니를 작은 조각으로 나눕니다. 그런 다음 위상차 현미경을 사용하여 콜로니가 성공적으로 조각으로 분할되었는지 확인합니다.
마지막으로, 100 마이크로리터 피펫으로 콜로니를 준비된 96 웰 플레이트로 옮기고, 피펫을 콜로니 위에 똑바로 세웁니다. 세포가 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 방해 없이 하룻밤 동안 부착되도록 합니다. 다음 날, 배지를 200 마이크로리터의 신선한 hiPSC 배양 배지로 교체하여 ROCK 억제제 Y-27632를 제거하고 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣습니다.
96 웰 플레이트를 모니터링하고 성공적으로 선택된 클론으로 웰을 표시합니다. 표시된 클론은 이 시점에서 확장 및 고정할 수 있습니다. 위상차 이미지는 성공적으로 재프로그래밍된 hiPSC 콜로니, 선택된 hiPSC, 자발적으로 분화된 콜로니, 비 hiPSC 콜로니 및 너무 조밀한 hiPSC 배양이 제시됩니다.