Para começar, pegue a placa de fibroblastos eletroporados e observe a formação de colônias de hiPSC em um microscópio de contraste de fase objetiva de 10x a 20x. As colônias hiPSC com diâmetro de 300 micrômetros, bordas distintas e uma alta relação núcleo/corpo são adequadas para picking. Antes de colher, cubra os poços de uma placa de 96 poços adequada para a cultura hiPSC com 100 microlitros de solução de revestimento.
E incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Durante a incubação, marque as colônias de interesse no fundo da placa de cultura celular com uma caneta. Para a preparação final da placa de 96 poços, remova a solução de revestimento e adicione 100 microlitros de meio de cultura hiPSC pré-aquecido, contendo 10 micromoles de inibidor de ROCK Y-27632 em cada poço.
Em seguida, lave as células com PBS pré-aquecido e adicione meio de cultura hiPSC pré-aquecido fresco contendo 10 micromoles do inibidor de ROCK Y-27632 antes de escolher para remover as células mortas. Escolha as colônias hiPSC usando uma agulha de calibre e divida as colônias em pequenos pedaços desenhando uma grade em cada colônia. Depois, use um microscópio de contraste de fase para verificar se as colônias são divididas com sucesso em pedaços.
Finalmente, transfira as colônias com uma pipeta de 100 microlitros para a placa preparada de 96 poços, mantendo a pipeta na vertical sobre a colônia. Permita que as células se liguem durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono sem perturbação. No dia seguinte, substituir o meio por 200 microlitros de meio de cultura fresco hiPSC para remover o inibidor de ROCK Y-27632 e colocar as placas de volta na incubadora.
Monitore a placa de 96 poços e marque os poços com clones colhidos com sucesso. Os clones marcados podem ser expandidos e congelados neste ponto. Imagens de contraste de fase reprogramaram com sucesso colônias hiPSC, hiPSCs selecionadas, colônias espontaneamente diferenciadas, colônias não-hiPSC e uma cultura hiPSC muito densa são apresentadas.