Börja med att ta plattan med elektroporerade fibroblaster och observera bildandet av hiPSC-kolonier under ett 10x till 20x objektivt faskontrastmikroskop. HiPSC-kolonierna med 300 mikrometer diameter, distinkta gränser och ett högt förhållande mellan kärnor och kropp är lämpliga för plockning. Innan du plockar, belägg brunnarna på en 96-brunnsplatta som är lämplig för hiPSC-kultur med 100 mikroliter beläggningslösning.
Och inkubera i en timme vid 37 grader Celsius. Under inkubation markerar du kolonierna av intresse längst ner i cellodlingsskålen med en penna. För den slutliga beredningen av 96-brunnsplattan, avlägsna beläggningslösningen och tillsätt 100 mikroliter förvärmt hiPSC-odlingsmedium, innehållande 10 mikromol ROCK-hämmare Y-27632 till varje brunn.
Tvätta sedan cellerna med förvärmd PBS och tillsätt färskt förvärmt hiPSC-odlingsmedium innehållande 10 mikromol ROCK-hämmare Y-27632 innan du plockar för att ta bort döda celler. Välj hiPSC-kolonierna med en mätnål och dela kolonierna i små bitar genom att dra ett rutnät i varje koloni. Använd sedan ett faskontrastmikroskop för att kontrollera att kolonierna är framgångsrikt uppdelade i bitar.
Slutligen överför kolonierna med en 100 mikroliter pipett till den förberedda 96-brunnsplattan och håll pipetten upprätt över kolonin. Låt cellerna fästa över natten vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid utan störningar. Följande dag, byt ut mediet med 200 mikroliter färskt hiPSC-odlingsmedium för att avlägsna ROCK-hämmaren Y-27632 och placera plattorna tillbaka i inkubatorn.
Övervaka 96-brunnsplattan och markera brunnarna med framgångsrikt plockade kloner. De markerade klonerna kan expanderas och frysas vid denna tidpunkt. Faskontrastbilder har framgångsrikt omprogrammerat hiPSC-kolonier, utvalda hiPSC, spontant differentierade kolonier, icke-hiPSC-kolonier och en för tät hiPSC-kultur presenteras.
