Başlamak için, elektropora fibroblastların plakasını alın ve 10x ila 20x objektif faz kontrast mikroskobu altında hiPSC kolonilerinin oluşumunu gözlemleyin. 300 mikrometre çapında, farklı sınırlara ve yüksek çekirdek/gövde oranına sahip hiPSC kolonileri toplama için uygundur. Toplamadan önce, hiPSC kültürüne uygun 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarını 100 mikrolitre kaplama çözeltisi ile kaplayın.
Ve 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Kuluçka sırasında, hücre kültürü kabının altındaki ilgi kolonilerini bir kalemle işaretleyin. 96 kuyucuklu plakanın son hazırlığı için, kaplama çözeltisini çıkarın ve her bir kuyucuğa 10 mikromol ROCK inhibitörü Y-27632 içeren 100 mikrolitre önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ekleyin.
Daha sonra, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın ve ölü hücreleri çıkarmak için toplamadan önce 10 mikromol ROCK inhibitörü Y-27632 içeren taze önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ekleyin. Bir ölçü iğnesi kullanarak hiPSC kolonilerini seçin ve her koloniye bir ızgara çizerek kolonileri küçük parçalara bölün. Daha sonra, kolonilerin başarılı bir şekilde parçalara ayrıldığını kontrol etmek için bir faz kontrast mikroskobu kullanın.
Son olarak, kolonileri 100 mikrolitrelik bir pipetle hazırlanan 96 kuyucuk plakasına aktarın ve pipeti koloni üzerinde dik tutun. Hücrelerin gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bozulmadan bağlanmasına izin verin. Ertesi gün, ROCK inhibitörü Y-27632'yi çıkarmak ve plakaları inkübatöre geri yerleştirmek için ortamı 200 mikrolitre taze hiPSC kültür ortamı ile değiştirin.
96 kuyu plakasını izleyin ve kuyucukları başarıyla seçilmiş klonlarla işaretleyin. İşaretli klonlar bu noktada genişletilebilir ve dondurulabilir. Faz kontrast görüntüleri hiPSC kolonilerini başarıyla yeniden programlamış, seçilmiş hiPSC'ler, kendiliğinden farklılaşmış koloniler, hiPSC olmayan koloniler ve çok yoğun bir hiPSC kültürü sunulmuştur.
