På dag ett efter kromatintvärbindning och kärnuppsamling från 5 000 unga vuxna Caenorhabditis Elegans maskar, överför kärnornas pellet återsuspenderad i 450 mikroliter rent vatten till ett rent 1, 5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt sedan 60 mikroliter 10X DPN2-restriktionsenzymbuffert till den och blanda väl. Inkubera proverna med 15 mikroliter 10% natriumdodecylsulfat vid 37 grader Celsius i en timme under omrörning.
Släck reaktionen genom att tillsätta 75 mikroliter 20% triton X 100 och inkubera som visats tidigare. Alikvot 10 mikroliter från provet, som den osmälta kontrollen, och förvara den vid fyra grader Celsius. Efter tillsats av 400 enheter DPN 2 till resten av provet, inkubera det över natten vid 37 grader Celsius med omrörning för kromatinuppslutning.
På dag två lägger du till ytterligare 200 enheter DPN 2 i provet. För att slutföra uppslutningen av det tvärbundna provet, inkubera det vid 37 grader Celsius med omrörning i fyra timmar. Värmeinaktivera restriktionsenzymet genom att inkubera provet i 20 minuter vid 65 grader Celsius.
Om enzymet inte kan inaktiveras genom värme, tillsätt 80 mikroliter 10% natriumdodecylsulfat och inkubera. Tillsätt sedan 375 mikroliter 20% Triton X 100 till provet och blanda genom att virvla. Lägg undan en alikvot på 10 mikroliter från provet som matsmältningskontroll.
För kromatinligering, överför provet till ett rent 50 ml koniskt rör. Justera provvolymen till 5,7 ml med vatten av molekylär kvalitet och blanda genom att virvla. Tillsätt sedan 700 mikroliter 10 X T4-ligasbuffert, följt av 60 enheter T4-DNA-ligas, och inkubera provet över natten vid 16 grader Celsius.
På dag tre, fortsätt med proteinsmältning och omvänd tvärbindning. Tillsätt 30 mikroliter 10 milligram per milliliter proteinas K till 3C-provet och inkubera vid 65 grader Celsius över natten med omrörning. För att påbörja rening av 3C-biblioteket på dag fyra, tillsätt 30 mikroliter 10 milligram per milliliter RNas A till provet och blanda genom att virvla.
Efter inkubation tillsätts sju ml fenylkloroform till proverna och blandas genom skakning. Centrifugera provet i 15 minuter vid 3, 270 G och rumstemperatur. Samla upp och överför vattenfasen till ett rent 50 ml koniskt rör.
Tillsätt lika stora volymer kloroform och blanda provet genom skakning. Efter centrifugering av provet igen enligt demonstrationen, överför vattenfasen till ett annat rent 50 ml koniskt rör. Tillsätt 7,5 ml vatten av molekylär kvalitet, 35 ml 100% etanol och sju mikroliter ett milligram per milliliter glykogen.
Frys det korrekt blandade provet vid minus 80 grader Celsius. Medan provet fryser, börja rena kontrollproverna genom att justera kontrollvolymen till 500 mikroliter med vatten av molekylär kvalitet. Tillsätt två mikroliter 10 milligram per milliliter RNas A och blanda genom att vrida röret.
Tillsätt sedan en milliliter fenylkloroform till rören som innehåller kontrollerna och blanda genom att skaka. Centrifugera rören. Efter överföring av vattenfasen till ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt lika stora volymer kloroform.
Centrifugera enligt tidigare demonstration innan vattenfasen uppsamlas. Till den uppsamlade vattenfasen tillsätt en milliliter etanol och två mikroliter av ett milligram per milliliter glykogen. Efter blandning av provet genom skakning, inkubera det vid minus 80 grader Celsius i 30 minuter.
Därefter centrifugera provet i 15 minuter vid 3 270 G vid fyra grader Celsius. Efter avlägsnande av supernatanten, tillsätt 750 mikroliter kyld 70% etanol och centrifug. Återsuspendera den lufttorkade pelleten i 50 mikroliter vatten av molekylär kvalitet.
Suspensionen kan frysas här om den inte fortsätter omedelbart. För att fortsätta med 3C-provreningen, ta bort provet från frysen och centrifugera vid 3, 270 G i 30 minuter. Tillsätt 10 ml kyld 70% etanol och bryt upp DNA-pelleten.
Efter centrifugering och avlägsnande av supernatanten, lufttorka provet delvis vid rumstemperatur. Återsuspendera pelleten i 150 mikroliter 10 millimolar tris HCL vid pH 7,5 genom pipettering upp och ner för att erhålla det renade 3C-biblioteket. QPCR utförd på ett experimentellt och två kontroll 3C-prover hjälpte till att generera data om matsmältningseffektivitet.
3C-provet hade en cirka 88% matsmältningseffektivitet över de sju testade genomiska locierna.
