Pour commencer, préparez deux millilitres de formol à 4% ou tout autre fixateur approprié. Gardez également une boîte de Pétri, une pince et des ciseaux chirurgicaux prêts avant de commencer la procédure. Placez le poisson cryoblessé correctement euthanasié dans une boîte de Pétri contenant de l’eau désionisée.
À l’aide de ciseaux, effectuez une coupe à travers le corps, antérieure et postérieure au pédoncule caudal. Laissez le tissu saigner dans l’eau désionisée à l’intérieur de la boîte de Pétri. À l’aide de pinces, recueillir et transférer le pédoncule caudale dans la solution fixatrice préparée dans un tube microcentrifugeux.
Retourner soigneusement le tube plusieurs fois. Avant de monter, lavez les tissus fixes dans du PBS pendant 10 minutes sur une bascule. Ensuite, transférez-le dans un tube microcentrifuge de deux millilitres contenant une solution de 30% de saccharose dans de l’eau désionisée, pré-refroidi à quatre degrés Celsius et retournez doucement le tube plusieurs fois.
Laissez le tube à la verticale à 4 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Remplissez un moule d’encastrement avec une couche de cinq millimètres de support de montage OCT. À l’aide d’une pince, placez le pédoncule caudale au fond du moule.
Ajustez son orientation pour les sections transversales ou coronales. Laissez le milieu geler dans une boîte de glace sèche. Dès que le tissu est stabilisé dans la position souhaitée, remplissez le reste du moule avant que l’OCT ne gèle complètement.
Conservez le moule à 80 degrés Celsius pendant au moins une heure avant de sectionner le tissu à l’aide d’un cryostat. L’étendue de la cryolésion à différents jours après la cryoblessure, ou DPCI, a été analysée dans les sections du pédoncule caudale à l’aide d’une coloration trichrome composée de bleu d’aniline, de fuschin acide et d’orange-G. Les zones endommagées ont été déterminées par l’absence de coloration orange.
À 4 et 7 dpci, la section transversale présentait un muscle squelettique largement dégénéré dans le flanc cryoblessé du corps. L’analyse par immunofluorescence a montré qu’à 4 DPCI, le côté blessé du pédoncule caudale contenait des cellules DAPI positives abondantes, mais peu ou pas de F-actine et de tropomyosine 1, indiquant des muscles dégénérés. À 7 dpci, la tropomyosine 1 et la F-actine ont pu être détectées dans la plaie, près de la ligne médiane verticale du corps, indiquant le début de la formation de nouvelles myofibres.
À 30 dpci, les deux côtés du corps présentaient une distribution similaire de coloration F-actine, indiquant une restauration efficace des muscles squelettiques.
