Для начала приготовьте два миллилитра 4%-ного формалина или любого другого подходящего фиксатора. Также держите наготове чашку Петри, щипцы и хирургические ножницы перед началом процедуры. Поместите должным образом усыпленную криотравмированную рыбу в чашку Петри, содержащую деионизированную воду.
С помощью ножниц выполняют разрез по туловищу, спереди и кзади от хвостовой ножки. Дайте ткани вытечь в деионизированной воде внутри чашки Петри. С помощью щипцов собирают и переносят хвостовой цветонос в приготовленный фиксирующий раствор в микроцентрифужной пробирке.
Аккуратно переверните трубку несколько раз. Перед монтажом постирайте неподвижную ткань в PBS в течение 10 минут на коромысле. Затем переложите его в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку, содержащую раствор 30%-ной сахарозы в деионизированной воде, предварительно охлажденную до четырех градусов Цельсия, и аккуратно переверните пробирку несколько раз.
Оставьте трубку в вертикальном положении при температуре 4 градуса Цельсия не менее чем на 24 часа. Заполните форму для встраивания пятимиллиметровым слоем монтажной среды OCT. С помощью щипцов поместите хвостовой цветонос на дно формы.
Отрегулируйте его ориентацию для поперечных или корональных срезов. Дайте среде застыть в коробке с сухим льдом. Как только ткань стабилизируется в нужном положении, заполните оставшуюся форму до того, как ОКТ полностью замерзнет.
Храните форму при температуре 80 градусов Цельсия не менее одного часа, прежде чем разделить ткань с помощью криостата. Степень криотравмы в разные дни после криотравмы или DPCI была проанализирована на срезах хвостовой ножки с использованием трихромного окрашивания, состоящего из анилинового синего, кислотного фушин и оранжевого G. Поврежденные участки определяли по отсутствию оранжевого окрашивания.
При 4 и 7 dpci поперечный срез показал обширную дегенерацию скелетных мышц в криоповрежденной боковой части тела. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что при 4 DPCI поврежденная сторона каудальной ножки содержала большое количество DAPI-положительных клеток, но практически не содержала F-актина и тропомиозина 1, что указывает на дегенерацию мышц. При 7 dpci тропомиозин 1 и F-актин могут быть обнаружены в ране, близкой к вертикальной средней линии тела, что указывает на начало образования новых миофибрилл.
При 30 dpci обе стороны тела демонстрировали одинаковое распределение окрашивания F-актина, что указывает на эффективное восстановление скелетных мышц.