Name: Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells
Uploaded: 2023-05-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells at JoVE.com

embryonic heart cell thawing and removal of dead cells

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכבר ברזולוציה של תא בודד

Among birth defects, congenital heart defects (CHDs) are the most common, occurring in about 1% of live births each year1,2. Genetic mutations are identified in only a minority of cases, implying that other causes, such as abnormalities in gene regulation, are involved in the etiology of CHD2,3. Cardiac development is a complex process of diverse and interacting cell types, making the identification of causal noncoding mutations and their effects on gene regulation challenging. Organogenesis of the heart begins with cellular progenitors that give rise to different subtypes of cardiac cells, including myocardial, fibroblast, epicardial, and endocardial cells4,5.&#160;Single-cell genomics is emerging as a key method for studying heart development and assessing the impact of cellular heterogeneity in health and disease6. The development of multi-omics methods for the simultaneous measurement of different parameters and the expansion of computational pipelines has facilitated the discovery of cell types and subtypes in the normal and diseased heart6. This article describes a reliable single-nucleus isolation protocol for frozen cardiac progenitor cells obtained from mouse embryos that is compatible with downstream snRNA-seq and snATAC-seq (as well as snRNA-seq and snATAC-seq combined)7,8,9.
ATAC-seq is a robust method that allows the identification of regulatory open chromatin regions and the positioning of nucleosomes10,11. This information is used to draw conclusions about the location, identity, and activity of transcription factors. The activity of chromatin factors, including remodelers, as well as the transcriptional activity of RNA polymerase, can, thus, be analyzed since the method is highly sensitive for measuring quantitative changes in chromatin structure1,2. Thus, ATAC-seq provides a robust and impartial approach to uncovering the mechanisms controlling transcriptional regulation in a specific cell type. ATAC-seq protocols have also been validated to measure chromatin accessibility in single cells, revealing variability in the chromatin architecture within cell populations10,12,13.
Although there have been notable advances in the field of single cells in recent years, the main difficulty is the processing of the fresh samples needed to perform these experiments14. To circumvent this difficulty, various tests have been carried out with the aim of conducting analyses such as snRNA-seq and snATAC-seq with frozen cardiac tissue or cells15,16.
Several platforms have been used to analyze single-cell genomics data17. The widely used platforms for single-cell gene expression and ATAC profiling are platforms for multiple microfluidic droplet encapsulation17. As these platforms use microfluidic chambers, debris or aggregates can clog the system, resulting in non-usable data. Thus, the success of single-cell studies depends on the accurate isolation of individual cells/nuclei.
The protocol presented here uses a similar approach to recent studies using snRNA-seq and snATAC-seq to understand congenital heart defects18,19,20,21,22,23. This procedure utilizes the enzymatic dissociation of freshly microdissected cardiac tissue followed by the cryopreservation of mouse cardiac progenitor cells. After thawing, the viable cells are purified and processed for nuclear isolation. In this work, this protocol was successfully used to obtain snRNA-seq and snATAC-seq data from the same nuclear preparation of mouse cardiac progenitor cells.

מחבר זרקור: בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד  

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

The main objective of this protocol is to study the interaction of genetic and environmental factors in the context of heart development and their contribution to congenital heart defects. Single nuclei approaches such as single nuclei RNA-seq and single nuclei ataxic are emerging as key methods to study cellular heterogeneity in health and disease during heart development. One limiting step of these experiments is that all the sample have to be run simultaneously.While working with all the experimental conditions, collecting fresh enough material is for all the condition simultaneously could be challenging. Although there have been a significant progress in the field in single cell for recent years, the main difficulty is processing free samples. Avoiding the difficulty is extremely benefit to identify the molecular mechanism underlying congenital heart disease defects.This protocol describes the steps to follow for successfully isolating high quality nuclei from frozen cardiac cell suspension obtained from mouse embryos. And our protocol is compatible with downstream single nuclei RNA-seq and single nuclei ataxic. We hope that this procedure will help interested researchers and encourage them to use this powerful method for their research.

Watch this Scientific Journal Video about Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells at JoVE.com

Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells  

הפשרת תאי לב עובריים והסרת תאים מתים

התחל על ידי הנחת תרחיף תאי לב עוברי מנותק קפוא המכיל בקבוקוני קריו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך דקה עד שתי דקות. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום שלם, שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס לתרחיף המופשר ומערבבים שלוש פעמים עם פיפטה. לאחר מכן להעביר את ההשעיה צינור חרוטי 15 מיליליטר, המכיל 10 מ"מ של מדיום שלם חם.מעבירים את כל מתלה התא על מסננת של 30 מיקרומטר ושוטפים את המסננת במיליליטר אחד עד שניים של תווך חם ושלם. אספו את הזרימה באותו צינור חרוט. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב 300 G במשך חמש דקות.לאחר הסרת הסופרנטנט, שטפו את הגלולה עם PBS והעבירו את תרחיף התא לתוך צינור מיקרו של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את תרחיף התא ולהוסיף 100 מיקרוליטר של microbeads מגנטיים שסופקו לתאים כדורים. הומוגניזציה של המתלה חמש פעמים באמצעות קצה פיפטה חזיר רחב לפני 15 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר.בינתיים, שטפו את עמוד ההפרדה המגנטי עם 500 מיקרוליטר של חיץ קשירה. לאחר השלמת הדגירה, דללו את תערובת תרחיף תאי המיקרו-חרוזים באמצעות 500 מיקרוליטר של חיץ קשירה. לאחר מכן, הוסף 0.6 מיליליטר של תרחיף התא לעמודת ההפרדה המגנטית.לאסוף את שפכי התא החי בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את צינור המיקרו 1.5 מיליליטר שהכיל את תרחיף התא באמצעות מיליליטר אחד של חיץ קשירה. לאחר השטיפה, מעבירים את חיץ הקישור מצינור המיקרו 1.5 מיליליטר לעמוד ואוספים את השפכים באותו צינור 15 מיליליטר.חזור על השטיפה של צינור 1.5 מיליליטר באמצעות מיליליטר אחד של חיץ קשירה. לאחר צנטריפוגה של השפכים ב 300 גרם במשך חמש דקות, להסיר את supernatant מבלי להפריע גלולת התא. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת PBS BSA וערבב בעדינות על ידי פיפטינג באמצעות קצה פיפטה פתח רחב.לאחר מכן להעביר את השעיית התא לתוך צינור מיקרו 1.5 מיליליטר. שוב, צנטריפוגו את מתלה התא והוציאו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. חזור על שתי שטיפות של מיליליטר אחד של PBS BSA.לאחר הסרת מיליליטר אחד של PBS BSA, להשעות מחדש את התאים ב 100 מיקרוליטר של תמיסת PBS BSA. מערבבים אותו על ידי pipetting 10 פעמים. לקבוע את הריכוז על ידי ביצוע בדיקת טריפאן כחול כדי להבטיח ספירת תאים של יותר או שווה ל 100, 000 תאים ולבצע הערכה מבוססת פלואורסצנטיות עבור הכדאיות של התאים.השלב הנוסף של מיון והסרת התאים המתים לאחר ההפשרה איפשר רכישת תרחיף תאים נקי יותר עם כדאיות תאים גבוהה משמעותית ושיפר את איכות הדגימה ההתחלתית. ליתר דיוק, נעשה שימוש בשתי שיטות ספירה שונות כדי לכמת את התאים והגרעינים, כולל כחול טריפאן והערכה מבוססת פלואורסצנטיות של הכדאיות. בפרוטוקול זה נצפה כי כדאיות התא עברה מ-80% ל-90% לפני בידוד גרעינים לפחות מ-5% לאחר בידוד גרעינים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...