Name: Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells
Uploaded: 2023-05-12T14:30:00
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embryonic heart cell thawing and removal of dead cells

Isolamento de núcleos de células progenitoras cardíacas de camundongos em resolução de célula única

Among birth defects, congenital heart defects (CHDs) are the most common, occurring in about 1% of live births each year1,2. Genetic mutations are identified in only a minority of cases, implying that other causes, such as abnormalities in gene regulation, are involved in the etiology of CHD2,3. Cardiac development is a complex process of diverse and interacting cell types, making the identification of causal noncoding mutations and their effects on gene regulation challenging. Organogenesis of the heart begins with cellular progenitors that give rise to different subtypes of cardiac cells, including myocardial, fibroblast, epicardial, and endocardial cells4,5.&#160;Single-cell genomics is emerging as a key method for studying heart development and assessing the impact of cellular heterogeneity in health and disease6. The development of multi-omics methods for the simultaneous measurement of different parameters and the expansion of computational pipelines has facilitated the discovery of cell types and subtypes in the normal and diseased heart6. This article describes a reliable single-nucleus isolation protocol for frozen cardiac progenitor cells obtained from mouse embryos that is compatible with downstream snRNA-seq and snATAC-seq (as well as snRNA-seq and snATAC-seq combined)7,8,9.
ATAC-seq is a robust method that allows the identification of regulatory open chromatin regions and the positioning of nucleosomes10,11. This information is used to draw conclusions about the location, identity, and activity of transcription factors. The activity of chromatin factors, including remodelers, as well as the transcriptional activity of RNA polymerase, can, thus, be analyzed since the method is highly sensitive for measuring quantitative changes in chromatin structure1,2. Thus, ATAC-seq provides a robust and impartial approach to uncovering the mechanisms controlling transcriptional regulation in a specific cell type. ATAC-seq protocols have also been validated to measure chromatin accessibility in single cells, revealing variability in the chromatin architecture within cell populations10,12,13.
Although there have been notable advances in the field of single cells in recent years, the main difficulty is the processing of the fresh samples needed to perform these experiments14. To circumvent this difficulty, various tests have been carried out with the aim of conducting analyses such as snRNA-seq and snATAC-seq with frozen cardiac tissue or cells15,16.
Several platforms have been used to analyze single-cell genomics data17. The widely used platforms for single-cell gene expression and ATAC profiling are platforms for multiple microfluidic droplet encapsulation17. As these platforms use microfluidic chambers, debris or aggregates can clog the system, resulting in non-usable data. Thus, the success of single-cell studies depends on the accurate isolation of individual cells/nuclei.
The protocol presented here uses a similar approach to recent studies using snRNA-seq and snATAC-seq to understand congenital heart defects18,19,20,21,22,23. This procedure utilizes the enzymatic dissociation of freshly microdissected cardiac tissue followed by the cryopreservation of mouse cardiac progenitor cells. After thawing, the viable cells are purified and processed for nuclear isolation. In this work, this protocol was successfully used to obtain snRNA-seq and snATAC-seq data from the same nuclear preparation of mouse cardiac progenitor cells.

Autor em destaque: Isolamento de núcleos de células progenitoras cardíacas de camundongos para epigenoma e perfil de expressão gênica em resolução de célula única  

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

The main objective of this protocol is to study the interaction of genetic and environmental factors in the context of heart development and their contribution to congenital heart defects. Single nuclei approaches such as single nuclei RNA-seq and single nuclei ataxic are emerging as key methods to study cellular heterogeneity in health and disease during heart development. One limiting step of these experiments is that all the sample have to be run simultaneously.While working with all the experimental conditions, collecting fresh enough material is for all the condition simultaneously could be challenging. Although there have been a significant progress in the field in single cell for recent years, the main difficulty is processing free samples. Avoiding the difficulty is extremely benefit to identify the molecular mechanism underlying congenital heart disease defects.This protocol describes the steps to follow for successfully isolating high quality nuclei from frozen cardiac cell suspension obtained from mouse embryos. And our protocol is compatible with downstream single nuclei RNA-seq and single nuclei ataxic. We hope that this procedure will help interested researchers and encourage them to use this powerful method for their research.

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Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells  

Descongelamento de Células Cardíacas Embrionárias e Remoção de Células Mortais

Comece colocando a suspensão de células cardíacas embrionárias dissociadas congeladas contendo frascos de crio em banho-maria de 37 graus Celsius por um a dois minutos. Adicione um mililitro de meio completo, pré-aquecido a 37 graus Celsius à suspensão descongelada e misture três vezes com uma pipeta. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros, contendo 10 milímetros de meio completo quente.Passe toda a suspensão da célula sobre um filtro de 30 micrômetros e lave o filtro com um a dois mililitros de meio quente e completo. Colete o fluxo através do mesmo tubo cônico. Em seguida, centrifugar os tubos a 300 G por cinco minutos.Após a remoção do sobrenadante, lave o pellet com PBS e transfira a suspensão celular para um microtubo de 1,5 mililitro. Centrifugar a suspensão celular e adicionar 100 microlitros das microesferas magnéticas fornecidas às células peletizadas. Homogeneizar a suspensão cinco vezes com uma ponta larga de pipeta de javali antes de 15 minutos de incubação à temperatura ambiente.Enquanto isso, enxágue a coluna de separação magnética com 500 microlitros de tampão de ligação. Uma vez concluída a incubação, diluir a mistura de suspensão de células de microesferas usando 500 microlitros de tampão de ligação. Em seguida, adicione 0,6 mililitros da suspensão da célula à coluna de separação magnética.Coletar o efluente de células vivas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, enxágue o microtubo de 1,5 mililitro que continha a suspensão celular usando um mililitro de tampão de ligação. Após o enxágue, transfira o tampão de ligação do microtubo de 1,5 mililitro para a coluna e colete o efluente no mesmo tubo de 15 mililitros.Repita o enxágue do tubo de 1,5 mililitro usando um mililitro de tampão de ligação. Depois de centrifugar o efluente a 300 G por cinco minutos, remova o sobrenadante sem interromper o pellet celular. Adicione um mililitro da solução PBS BSA e misture suavemente por pipetagem usando uma ponta de pipeta de orifício largo.Em seguida, transfira a suspensão celular para um microtubo de 1,5 mililitro. Novamente, centrifugar a suspensão celular e remover o sobrenadante sem interromper a pastilha celular. Repita as duas lavagens de um mililitro de PBS BSA.Após remover um mililitro de PBS BSA, ressuspenda as células em 100 microlitros de solução PBS BSA. Misture pipetando 10 vezes. Determinar a concentração realizando um ensaio de azul de tripano para garantir uma contagem de células maior ou igual a 100.000 células e realizar uma avaliação baseada em fluorescência para a viabilidade das células.A etapa adicional de triagem e remoção das células mortas após o descongelamento permitiu a obtenção de uma suspensão de células mais limpas com viabilidade celular significativamente maior e melhorou a qualidade da amostra inicial. Para maior precisão, dois diferentes métodos de contagem foram usados para quantificar as células e núcleos, incluindo o azul de tripano e a avaliação da viabilidade baseada em fluorescência. Nesse protocolo, observou-se que a viabilidade celular passou de 80 a 90% antes do isolamento dos núcleos para menos de 5% após o isolamento dos núcleos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...