Name: Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells
Uploaded: 2023-05-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells at JoVE.com

embryonic heart cell thawing and removal of dead cells

Tek Hücre Çözünürlüğünde Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

Among birth defects, congenital heart defects (CHDs) are the most common, occurring in about 1% of live births each year1,2. Genetic mutations are identified in only a minority of cases, implying that other causes, such as abnormalities in gene regulation, are involved in the etiology of CHD2,3. Cardiac development is a complex process of diverse and interacting cell types, making the identification of causal noncoding mutations and their effects on gene regulation challenging. Organogenesis of the heart begins with cellular progenitors that give rise to different subtypes of cardiac cells, including myocardial, fibroblast, epicardial, and endocardial cells4,5.&#160;Single-cell genomics is emerging as a key method for studying heart development and assessing the impact of cellular heterogeneity in health and disease6. The development of multi-omics methods for the simultaneous measurement of different parameters and the expansion of computational pipelines has facilitated the discovery of cell types and subtypes in the normal and diseased heart6. This article describes a reliable single-nucleus isolation protocol for frozen cardiac progenitor cells obtained from mouse embryos that is compatible with downstream snRNA-seq and snATAC-seq (as well as snRNA-seq and snATAC-seq combined)7,8,9.
ATAC-seq is a robust method that allows the identification of regulatory open chromatin regions and the positioning of nucleosomes10,11. This information is used to draw conclusions about the location, identity, and activity of transcription factors. The activity of chromatin factors, including remodelers, as well as the transcriptional activity of RNA polymerase, can, thus, be analyzed since the method is highly sensitive for measuring quantitative changes in chromatin structure1,2. Thus, ATAC-seq provides a robust and impartial approach to uncovering the mechanisms controlling transcriptional regulation in a specific cell type. ATAC-seq protocols have also been validated to measure chromatin accessibility in single cells, revealing variability in the chromatin architecture within cell populations10,12,13.
Although there have been notable advances in the field of single cells in recent years, the main difficulty is the processing of the fresh samples needed to perform these experiments14. To circumvent this difficulty, various tests have been carried out with the aim of conducting analyses such as snRNA-seq and snATAC-seq with frozen cardiac tissue or cells15,16.
Several platforms have been used to analyze single-cell genomics data17. The widely used platforms for single-cell gene expression and ATAC profiling are platforms for multiple microfluidic droplet encapsulation17. As these platforms use microfluidic chambers, debris or aggregates can clog the system, resulting in non-usable data. Thus, the success of single-cell studies depends on the accurate isolation of individual cells/nuclei.
The protocol presented here uses a similar approach to recent studies using snRNA-seq and snATAC-seq to understand congenital heart defects18,19,20,21,22,23. This procedure utilizes the enzymatic dissociation of freshly microdissected cardiac tissue followed by the cryopreservation of mouse cardiac progenitor cells. After thawing, the viable cells are purified and processed for nuclear isolation. In this work, this protocol was successfully used to obtain snRNA-seq and snATAC-seq data from the same nuclear preparation of mouse cardiac progenitor cells.

Yazar Spotlight: Tek Hücre Çözünürlüğünde Epigenom ve Gen İfadesi Profili Oluşturma için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu  

Epigenom ve Tek Hücre Çözünürlüğünde Gen Ekspresyon Profillemesi için Fare Kardiyak Progenitör Hücrelerinden Çekirdek İzolasyonu

The main objective of this protocol is to study the interaction of genetic and environmental factors in the context of heart development and their contribution to congenital heart defects. Single nuclei approaches such as single nuclei RNA-seq and single nuclei ataxic are emerging as key methods to study cellular heterogeneity in health and disease during heart development. One limiting step of these experiments is that all the sample have to be run simultaneously.While working with all the experimental conditions, collecting fresh enough material is for all the condition simultaneously could be challenging. Although there have been a significant progress in the field in single cell for recent years, the main difficulty is processing free samples. Avoiding the difficulty is extremely benefit to identify the molecular mechanism underlying congenital heart disease defects.This protocol describes the steps to follow for successfully isolating high quality nuclei from frozen cardiac cell suspension obtained from mouse embryos. And our protocol is compatible with downstream single nuclei RNA-seq and single nuclei ataxic. We hope that this procedure will help interested researchers and encourage them to use this powerful method for their research.

Watch this Scientific Journal Video about Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells at JoVE.com

Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells  

Embriyonik Kalp Hücresi Çözülmesi ve Ölü Hücrelerin Uzaklaştırılması

Kriyo şişeleri içeren dondurulmuş ayrışmış embriyonik kalp hücresi süspansiyonunu bir ila iki dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirerek başlayın. Çözülmüş süspansiyona 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir mililitre tam ortam ekleyin ve bir pipetle üç kez karıştırın. Daha sonra süspansiyonu, 10 milimetre sıcak tam ortam içeren 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.Tüm hücre süspansiyonunu 30 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin ve süzgeci bir ila iki mililitre sıcak, tam ortamla durulayın. Akışı aynı konik tüpte toplayın. Ardından, tüpleri beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin.Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti PBS ile yıkayın ve hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikro tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve peletlenmiş hücrelere sağlanan manyetik mikroboncukların 100 mikrolitresini ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakikalık inkübasyondan önce geniş bir domuz pipet ucu kullanarak süspansiyonu beş kez homojenize edin.Bu arada, manyetik ayırma kolonunu 500 mikrolitre bağlama tamponu ile durulayın. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, mikroboncuk hücresi süspansiyon karışımını 500 mikrolitre bağlama tamponu kullanarak seyreltin. Ardından, manyetik ayırma sütununa 0,6 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.Canlı hücre atık suyunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu içeren 1,5 mililitrelik mikro tüpü bir mililitre bağlama tamponu kullanarak durulayın. Durulamadan sonra, bağlama tamponunu 1,5 mililitrelik mikro tüpten kolona aktarın ve atık suyu aynı 15 mililitrelik tüpte toplayın.Bir mililitre bağlama tamponu kullanarak 1,5 mililitrelik tüpün durulanmasını tekrarlayın. Atık suyu beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj ettikten sonra, hücre peletini bozmadan süpernatantı çıkarın. PBS BSA çözeltisinden bir mililitre ekleyin ve geniş delikli pipet ucu kullanarak pipetleyerek yavaşça karıştırın.Daha sonra hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikro tüpe aktarın. Yine, hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve hücre peletini bozmadan süpernatantı çıkarın. Bir mililitre PBS BSA'nın iki yıkamasını tekrarlayın.Bir mililitre PBS BSA'yı çıkardıktan sonra, hücreleri 100 mikrolitre PBS BSA çözeltisinde yeniden askıya alın. 10 kez pipetleyerek karıştırın. 100.000 hücreden fazla veya ona eşit bir hücre sayısı sağlamak için bir tripan mavisi testi yaparak konsantrasyonu belirleyin ve hücrelerin yaşayabilirliği için floresan bazlı bir değerlendirme yapın.Çözüldükten sonra ölü hücrelerin sıralanması ve çıkarılmasının ek adımı, önemli ölçüde daha yüksek hücre canlılığına sahip daha temiz bir hücre süspansiyonunun tedarik edilmesine izin verdi ve başlangıç numunesinin kalitesini artırdı. Daha fazla doğruluk için, hücreleri ve çekirdekleri ölçmek için, tripan mavisi ve canlılığın floresan bazlı değerlendirmesi de dahil olmak üzere iki farklı sayma yöntemi kullanılmıştır. Bu protokolde hücre canlılığının çekirdek izolasyonundan önce %80-90'dan çekirdek izolasyonundan sonra %5'in altına indiği gözlenmiştir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryonic Heart Cell Thawing and Removal of Dead Cells

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...