7-8주 된 안락사된 수컷 마우스를 깨끗한 벤치 표면에 놓는 것으로 시작합니다. 하복부쪽으로 가위로 마우스의 복부 피부를 자릅니다. 허벅지 안쪽에서 지방 조직을 절제하십시오.
절제된 조직을 FBS 또는 항생제 없이 효소 D, R, A의 효소 혼합물 2.5밀리리터와 DMEM/F12 2.35밀리리터가 들어 있는 얼음 위의 튜브 C에 넣습니다. 가위를 사용하여 지방 조직을 약 2 평방 밀리미터 크기의 조각으로 자릅니다. 튜브 C의 캡을 단단히 닫고 튜브를 뒤집습니다.
튜브를 조직 해리기의 슬리브에 부착하고 섭씨 37도에서 40분 동안 샘플을 분해합니다. 다음으로, FBS와 항생제가 포함된 DMEM/F12 배지를 섭씨 37도까지 예열합니다. 배양 후 조직 해리기에서 튜브 C를 제거하고 FBS 및 항생제와 함께 DMEM/F12 5밀리리터를 추가하여 소화를 중지합니다.
부드럽게 피펫을 네 번 합니다. 섭씨 20도에서 10분 동안 700g에서 현탁액을 원심분리합니다. 세포 팔레트를 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오.
FBS와 항생제가 들어 있는 DMEM/F12 10밀리리터에 펠릿을 재현탁하고 부드럽게 5회 피펫팅합니다. 50 밀리리터 튜브에 놓인 70 미크론 직경의 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과합니다. 여과액을 250g에서 5분 동안 원심분리합니다.
펠릿을 PBS 10 밀리리터에 재현 탁하십시오. 도금하기 전에, 세포 현탁액을 500g에서 5 분 동안 원심 분리한다. 상청액을 버리십시오.
FBS와 항생제가 함유된 DMEM/F12 10밀리리터에 펠릿을 재현탁합니다. 현탁액을 부드럽게 피펫팅하여 10회 혼합합니다. 10 밀리리터의 현탁액을 10 센티미터 콜라겐 코팅 접시에 담습니다.
접시를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 배지를 흡인하고 세척 당 3 밀리리터의 PBS로 세포를 3 회 세척하십시오. FBS와 항생제가 함유된 DMEM/F12 10밀리리터를 넣고 배양합니다.
Oil Red O 염색은 지방세포 분화를 유도한 지 7일 후에 지질이 함유된 지방세포를 나타냈다. 완전한 분화 정도는 지방생성 조절인자의 mRNA 발현 분석을 통해 확인하였다. 로시글리타존은 Ucp1 및 Ppargc1a와 같은 갈색 지방 특이적 유전자의 발현 수준에 대한 용량 의존적 효과를 유도하였다.
그러나, Fabp4의 경우, 0.1 마이크로몰 로시글리타존 농도에서 포화된 효과가 나타났다. 분화된 지방세포는 산소 소비율 분석 및 염색질 면역침전과 같은 다양한 기능적 및 기계론적 분석에 사용할 수 있습니다.