Avant la coloration immunofluorescente multiplex, fixer le tissu et effectuer la déparaffinisation et l’inhibition endogène de la peroxydase. Ensuite, pour la coloration immunofluorescente multiplexe, immergez les lames dans un pot de coloration de 300 millilitres contenant 10 millimolaires tampon de citrate complété par 0,1% de Triton X-100. Placez le pot de coloration avec le couvercle fermé au micro-ondes pendant trois à cinq minutes à puissance maximale jusqu’à ce que le tampon commence à bouillir.
Après ébullition, laissez le tampon à une température proche de l’ébullition en mettant le micro-ondes à faible puissance pendant 15 minutes. Encore une fois, chauffez la mémoire tampon en mettant le micro-ondes à puissance maximale pendant 90 secondes. Retirez le pot du four à micro-ondes et laissez le tampon refroidir pendant 15 minutes à température ambiante.
Rincer les lames trois fois pendant cinq minutes chacune dans de l’eau distillée, suivies de cinq minutes de rinçage dans une solution saline tamponnée Tris contenant 0,1 % de Tween 20 ou TBS Tween. Après le dernier lavage, retirez l’interpolation TBS en étalant les lames sur une serviette en papier. Ensuite, placez les lames sur une boîte de diapositives de microscope et entourez le tissu avec un stylo hydrophobe.
Bloquer les sites de liaison non spécifiques en recouvrant le tissu de 5% de BSA dissous dans TBS Tween. Après 30 minutes, retirez la mémoire tampon de blocage en épongeant les lames sur une serviette en papier. Ensuite, incuber le tissu pendant 60 minutes avec 300 microlitres d’anticorps primaires dilués dans 1% BSA, TBS Tween.
Après l’incubation, rincer les lames trois fois pendant trois minutes chacune avec TBS Tween. Après le lavage, incuber le tissu pendant 40 minutes avec 300 microlitres d’anticorps secondaire Poly-HRP. Après l’incubation, rincer les lames trois fois pendant trois minutes chacune avec TBS Tween.
Ensuite, incuber le tissu pendant 10 minutes avec 300 microlitres de réactif tyramide fluorochrome dilué 200 fois dans un tampon de borate extemporanément complété avec 0,003% de peroxyde d’hydrogène. Ensuite, rincez les lames trois fois avec TBS Tween et incuber le tissu pendant une nuit à quatre degrés Celsius avec un anticorps pan-cytokératine humain dilué dans 1% BSA, TBS Tween. Le lendemain, rincer le tissu avec TBS Tween et incuber pendant 120 minutes avec l’anticorps secondaire directement couplé au fluorochrome dilué 200 fois dans 1% BSA, TBS Tween.
Après l’incubation, rincer le tissu avec TBS Tween avant de colorer les noyaux avec du bisBenzimide dilué 1 000 fois dans 10% BSA, TBS Tween pendant cinq minutes. Rincez le mouchoir trois fois pendant trois minutes chacun dans de l’eau distillée avant de le monter sur une lame à l’aide d’un support de montage en fluorescence et d’un verre de couverture en borosilicate. Pour l’analyse d’images, importez les numérisations dans un logiciel d’analyse d’images.
Accédez ensuite à l’onglet Analyse et sélectionnez l’algorithme de fluorescence haut plex en cliquant sur Paramètres, Actions, puis sur Charger. Sélectionnez l’onglet Sélection du colorant et le colorant qui vous intéresse. Dans l’onglet Détection nucléaire, accédez à Type de segmentation nucléaire et sélectionnez AI Custom.
Ensuite, dans le classificateur de segmentation nucléaire, sélectionnez le AI.In entraîné enregistré dans l’onglet Détection de membrane et de cytoplasme, choisissez le rayon maximal du cytoplasme et le nombre de colorants membranaires. Pour chaque colorant, sélectionnez le seuil de noyau positif, le seuil cytoplasme positif et le seuil de membrane positif. Pour chaque colorant, sélectionnez le pourcentage de noyau, de membrane et de cytoplasme des valeurs d’exhaustivité.
Enregistrez l’algorithme en sélectionnant Paramètres, Actions et Enregistrer. Analysez la région d’intérêt en cliquant sur Analyser et en sélectionnant Calque d’annotation. Ensuite, accédez à l’onglet Résultats et sélectionnez toutes les données dans Données d’objet.
Exportez les données au format CSV en cliquant avec le bouton droit de la souris sur Exporter et en sélectionnant objectdata.csv. Un résultat représentatif de la coloration optimale par immunofluorescence multiplex est montré. Le choix de la dilution correcte était essentiel pour vérifier la spécificité des anticorps et optimiser le rapport signal sur bruit de la coloration.
