Før multiplex immunfluorescerende farging, fikser vevet og utfører deparaffinisering og endogen peroksidasehemming. For multiplex immunfluorescerende farging, senk lysbildene i en 300 milliliter fargekanne inneholdende 10 millimolar citratbuffer komplimentert med 0,1% Triton X-100. Plasser fargeglasset med lokket lukket i en mikrobølgeovn i tre til fem minutter med maksimal effekt til bufferen begynner å koke.
Etter koking, la bufferen ligge ved nær koketemperatur ved å sette mikrobølgeovnen på lav effekt i 15 minutter. Igjen, varme bufferen ved å sette mikrobølgeovnen på maksimal effekt i 90 sekunder. Fjern krukken fra mikrobølgeovnen og la bufferen avkjøles i 15 minutter ved romtemperatur.
Skyll lysbildene tre ganger i fem minutter hver i destillert vann, etterfulgt av fem minutters skylling i Tris-bufret saltvann som inneholder 0,1% mellom 20 eller TBS Tween. Etter siste vask, fjern TBS Tween ved å blotte lysbildene på et papirhåndkle. Deretter plasserer du lysbildene på en lysbildeboks i mikroskop og omkranser vevet med en hydrofob penn.
Blokker de uspesifikke bindingsstedene ved å dekke vevet med 5 % BSA oppløst i TBS Tween. Etter 30 minutter fjerner du blokkeringsbufferen ved å blotte lysbildene på et papirhåndkle. Deretter inkuberer vevet i 60 minutter med 300 mikroliter primært antistoff fortynnet i 1% BSA, TBS Tween.
Etter inkubering, skyll lysbildene tre ganger i tre minutter hver med TBS Tween. Etter vask, inkuber vevet i 40 minutter med 300 mikroliter Poly-HRP sekundært antistoff. Etter inkubering, skyll lysbildene tre ganger i tre minutter hver med TBS Tween.
Deretter inkuberer vevet i 10 minutter med 300 mikroliter fluorokromtyramidreagens fortynnet 200 ganger i boratbuffer ekstemporant tilsatt 0,003% hydrogenperoksid. Skyll deretter lysbildene tre ganger med TBS Tween og inkuber vevet over natten ved fire grader Celsius med humant pan-cytokeratinantistoff fortynnet i 1% BSA, TBS Tween. Neste dag, skyll vevet med TBS Tween og inkuber i 120 minutter med det sekundære antistoffet direkte koblet med fluorokrom fortynnet 200 ganger i 1% BSA, TBS Tween.
Etter inkubering, skyll vevet med TBS Tween før farging av kjernene med bisBenzimid fortynnet 1.000 ganger i 10% BSA, TBS Tween i fem minutter. Skyll vevet tre ganger i tre minutter hver i destillert vann før du monterer det på et lysbilde ved hjelp av et fluorescensmonteringsmedium og borosilikatdekselglass. For bildeanalyse, importer skanningene til et bildeanalyseprogram.
Gå deretter til kategorien Analyse og velg fluorescensalgoritmen med høy pleksel ved å klikke på Innstillinger, Handlinger og deretter Last inn. Velg kategorien Fargestoffvalg og fargestoffet av interesse. I kategorien Nuclear Detection går du til Nuclear Segmentation Type og velger AI Custom.
Deretter velger du den lagrede trente AI.In kategorien Membran- og cytoplasmadeteksjon i kategorien Kjernesegmenteringsklassifiserer, velger maksimal cytoplasmaradius og antall membranfarger. For hvert fargestoff velger du den nukleuspositive terskelen, cytoplasma-positive terskelen og den membranpositive terskelen. For hvert fargestoff velger du kjerne-, membran- og cytoplasmaprosentandelen av fullstendighetsverdier.
Lagre algoritmen ved å velge Innstillinger, Handlinger og Lagre. Analyser interesseområdet ved å klikke Analyser og velge Merknadslag. Gå deretter til kategorien Resultater og velg alle dataene i Objektdata.
Eksporter dataene i CSV-format ved å høyreklikke på Eksporter og velge objektdata.csv. Et representativt resultat av optimal farging ved multiplex immunfluorescens er vist. Valg av riktig fortynning var avgjørende for å verifisere antistoffspesifisiteten og optimalisere signal-støy-forholdet mellom fargingen.