Multipleks immünofloresan boyamadan önce, dokuyu düzeltin ve deparafinizasyon ve endojen peroksidaz inhibisyonu gerçekleştirin. Daha sonra multipleks immünofloresan boyama için, slaytları% 0.1 Triton X-100 ile tamamlanan 10 milimolar sitrat tamponu içeren 300 mililitrelik bir boyama kavanozuna batırın. Boyama kavanozunu kapağı kapalı olarak bir mikrodalgada, tampon kaynamaya başlayana kadar maksimum güçte üç ila beş dakika boyunca yerleştirin.
Kaynattıktan sonra, mikrodalgayı 15 dakika boyunca düşük güce koyarak tamponu kaynama sıcaklığına yakın bir sıcaklıkta bırakın. Yine, mikrodalgayı 90 saniye boyunca maksimum güce getirerek tamponu ısıtın. Kavanozu mikrodalgadan çıkarın ve tamponun oda sıcaklığında 15 dakika soğumasını bekleyin.
Slaytları damıtılmış suda her biri beş dakika boyunca üç kez durulayın, ardından %0,1 Tween 20 veya TBS Tween içeren Tris tamponlu salin içinde beş dakika durulayın. Son yıkamadan sonra, slaytları bir kağıt havlu üzerinde lekeleyerek TBS Arasını çıkarın. Ardından, slaytları bir mikroskop slayt kutusuna yerleştirin ve dokuyu hidrofobik bir kalemle çevreleyin.
TBS Arasında çözünmüş %5 BSA ile dokuyu kaplayarak spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin. 30 dakika sonra, slaytları bir kağıt havlu üzerinde lekeleyerek bloke tamponunu çıkarın. Daha sonra,% 1 BSA, TBS Ara'da seyreltilmiş 300 mikrolitre birincil antikor ile dokuyu 60 dakika boyunca inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, slaytları TBS Arası ile her biri üç dakika boyunca üç kez durulayın. Yıkadıktan sonra, dokuyu 300 mikrolitre Poly-HRP sekonder antikoru ile 40 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, slaytları TBS Arası ile her biri üç dakika boyunca üç kez durulayın.
Daha sonra, dokuyu% 0.003 hidrojen peroksit ile zamansız olarak takviye edilmiş borat tamponunda 200 kat seyreltilmiş 300 mikrolitre florokrom tiramid reaktifi ile 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra slaytları TBS Tween ile üç kez durulayın ve dokuyu% 1 BSA, TBS Tween'de seyreltilmiş insan pan-Sitokeratin antikoru ile dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, dokuyu TBS Tween ile durulayın ve %1 BSA, TBS Tween'de 200 kat seyreltilmiş florokrom ile doğrudan birleşmiş ikincil antikor ile 120 dakika boyunca inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, çekirdekleri bisBenzimide ile boyamadan önce dokuyu TBS Tween ile durulayın% 10 BSA, TBS Ara'da 1.000 kat seyreltilmiş beş dakika boyunca. Dokuyu, floresan montaj ortamı ve borosilikat kapak camı kullanarak bir slayta monte etmeden önce damıtılmış suda her biri üç dakika boyunca üç kez durulayın. Görüntü analizi için, taramaları bir görüntü analiz yazılımına aktarın.
Ardından Analiz sekmesine gidin ve Ayarlar, Eylemler ve ardından Yükle'yi tıklatarak yüksek katlı floresan algoritmasını seçin. Boya Seçimi sekmesini ve ilgilendiğiniz boyayı seçin. Nükleer Algılama sekmesinde, Nükleer Segmentasyon Türü'ne gidin ve AI Özel'i seçin.
Ardından Nükleer Segmentasyon Sınıflandırıcısında, Membran ve Sitoplazma Algılama sekmesinden AI.In kaydedilmiş eğitilmiş olanı seçin, maksimum sitoplazma yarıçapını ve membran boyalarının sayısını seçin. Her boya için çekirdek-pozitif eşiği, sitoplazma-pozitif eşiği ve membran-pozitif eşiği seçin. Her boya için, bütünlük değerlerinin çekirdek, membran ve sitoplazma yüzdesini seçin.
Ayarlar, Eylemler ve Kaydet'i seçerek algoritmayı kaydedin. Analiz Et'i tıklayıp Ek Açıklama Katmanı'nı seçerek ilgi alanlarını analiz edin. Ardından Sonuçlar sekmesine gidin ve Nesne verilerindeki tüm verileri seçin.
Dışa Aktar'a sağ tıklayıp objectdata.csv seçeneğini belirleyerek verileri CSV formatında dışa aktarın. Multipleks immünofloresan ile optimal boyamanın temsili bir sonucu gösterilmiştir. Doğru seyreltmeyi seçmek, antikor özgüllüğünü doğrulamak ve boyamanın sinyal-gürültü oranını optimize etmek için çok önemliydi.
