ابدأ الفحص بوضع نبات متلقي حبوب اللقاح A.thaliana المسمى على جانبه ، ووضع الزهرة المخصبة على مرحلة المجهر المقلوب لتصوير وصمة العار. لإصلاح موضع الزهرة المتلقية المخصوبة ، قم بشل حركة الجذع باستخدام شرائط من الشريط اللاصق. من النبات المتبرع بحبوب اللقاح ، قم بإزالة زهرة صحية ومفتوحة حديثا وضع النبات المتبرع بحبوب اللقاح تحت مجهر تشريح.
اجمع حبوب اللقاح باستخدام ملقط ناعم. قم بإزالة حبوب اللقاح الزائدة عن طريق لمس الملقط برفق ضد بتلات المتبرع حتى تتشكل الطبقة الأحادية لحبوب اللقاح. عد إلى النبات المتلقي لحبوب اللقاح واستخدم عدسة موضوعية منخفضة الطاقة لتركيز المجهر المقلوب على وصمة العار.
عقد ملقط على طول الفتحة بين أذرع الملقط ، ونهج بعناية وخلية الحليمة وصمة العار غير الملقحة. استمر في الاقتراب من خلية الحليمة الموصومة غير الملقحة حتى تتلامس حبوب اللقاح الموضوعة بشكل مناسب على الملقط الضوء مع سطحها. بمجرد تأكيد ارتباط حبوب اللقاح ، اسحب الملقط ببطء.
قم بتوجيه حبوب اللقاح مع محورها الاستوائي المرئي وفي تركيز حاد ، وانتقل على الفور إلى عدسة موضوعية ذات طاقة أعلى ، مثل 20x. التقط أول صورة لحبوب اللقاح ك T-0 ، واستمر في التقاط الصور على فترات دقيقة واحدة لمدة 10 دقائق. اضبط التركيز لاستيعاب الحركات الصغيرة في حبوب اللقاح أو وصمة العار.
سجل درجة الحرارة المحيطة بالغرفة والرطوبة النسبية كل دقيقتين ، مما يسمح بإجراء مقارنات مستقبلية بين النسخ المتماثلة التجريبية. احفظ الصور بتنسيق غير ضياع ، مثل ND2 ، قبل تكرار خطوات التلقيح والتصوير لحبوب اللقاح الإضافية للحصول على بيانات للتحكم والتلقيح التجريبي. ابدأ قياسات البيانات لمقايسة ترطيب حبوب اللقاح باستخدام برنامج تحليل الصور.
استخدم معلمات مماثلة للتكبير الرقمي والنهج الذي يحدد حدود حبوب اللقاح لجميع القياسات في مجموعات البيانات. سجل قيم المحور شبه الثانوي لجميع النقاط الزمنية في مجموعة البيانات. بمجرد اكتمال القياسات لمجموعة بيانات، قم بتصدير قيم المحور شبه الثانوي الخام لكل نقطة زمنية فردية إلى جدول بيانات.
قدم البيانات في أعمدة لكل مكدس صورة واحسب النسبة المئوية لتغيير المحور شبه الثانوي. كرر الخطوات واحصل على بيانات من 15 حبة لقاح رطبة على الأقل لكل خط نبات. قد تفشل بعض حبوب اللقاح في الترطيب أو قد ترطب بشكل أبطأ بكثير من المتوقع.
تعرف باسم الحبوب الفاشلة. استبعد هذه من مجموعة البيانات. احسب القيم المتوسطة لكل نقطة زمنية لكل مصنع باستخدام حزمة البرامج المتخصصة GraphPad Prism.
قم بتحليل بيانات الترطيب من الخطوط البرية والمتحولة في كل نقطة زمنية باستخدام اختبار T غير المزاوج و ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة وسائل نقطة الاهتمام الزمنية المحددة. لمقارنة الوسائل عبر جميع النقاط الزمنية ، قم بإجراء اختبارات T متعددة بين الخطوط البرية والطافرة عبر نقاط زمنية متعددة. أظهرت بيانات السلاسل الزمنية لترطيب حبوب اللقاح للنباتات البرية التي تم جمعها في أيام مختلفة أن القيم الدنيا والقصوى للوسائل بين النسخ المكررة لجميع النقاط الزمنية كانت في حدود 3٪ أظهرت هذه البيانات التمثيلية للتلقيح من النوع البري درجة عالية من الاتساق لأعداد العينات المنخفضة نسبيا وعبر أيام مختلفة.
