Begynd analysen ved at lægge den mærkede A.thaliana pollenmodtagerplante på sin side og placere den emaskulerede blomst på scenen i et omvendt mikroskop for at afbilde stigmaet. For at fastgøre positionen af den emasculerede modtagerblomst skal du immobilisere stammen ved hjælp af strimler af maskeringstape. Fjern en sund og nyåbnet blomst fra pollendonorplanten og placer pollendonorplanten under et dissekeringsmikroskop.
Saml pollenkorn ved hjælp af finspidsede tang. Fjern overskydende pollenkorn ved let at røre tangen mod donorbladene, indtil pollenkornets monolag er dannet. Gå tilbage til pollenmodtagerplanten og brug en objektiv linse med lav effekt til at fokusere det omvendte mikroskop på stigmaet.
Hold tangen langs åbningen mellem tangens arme, forsigtigt nærme sig og ubestøvet stigmatisk papillacelle. Fortsæt med at nærme dig den ubestøvede stigmatiske papillacelle, indtil det passende placerede pollenkorn på tangen får let kontakt med overfladen. Når pollenvedhæftningen er bekræftet, skal du langsomt trække tangen tilbage.
Orienter pollenkornet med sin ækvatoriale akse synlig og i skarpt fokus, og skift straks til en objektivlinse med højere effekt, som 20x. Tag det første pollenkornbillede som T-0, og fortsæt med at tage billeder med et minuts intervaller i 10 minutter. Juster fokus for at imødekomme små bevægelser i pollenkornet eller stigmaet.
Registrer rummets omgivelsestemperatur og relative luftfugtighed hvert andet minut, hvilket muliggør fremtidige sammenligninger mellem eksperimentelle replikater. Gem billederne i et tabsfrit format, såsom ND2, før du gentager bestøvnings- og billeddannelsestrinnene for yderligere pollenkorn for at indsamle data til kontrol og eksperimentelle bestøvninger. Start datamålingerne for pollenhydreringsanalyse ved hjælp af billedanalysesoftware.
Brug lignende parametre for digital zoom og den tilgang, der definerer pollengrænsen for alle målinger i datasættene. Registrer værdierne for den halve bitte akse for alle tidspunkter i datasættet. Når målingerne er fuldført for et datasæt, skal du eksportere de rå semiminor-akseværdier for hvert enkelt tidspunkt til et regneark.
Præsenter dataene i kolonner pr. billedstak, og beregn den procentvise ændring af halvminoraksen. Gentag trinene og få data fra mindst 15 hydrerede pollenkorn for hver plantelinje. Nogle få pollenkorn kan undlade at hydrere eller kan hydrere betydeligt langsommere end forventet.
De er kendt som mudderkorn. Udeluk disse fra datasættet. Beregn middelværdierne for hvert tidspunkt pr. anlæg ved hjælp af den specialiserede softwarepakke GraphPad Prism.
Analyser hydreringsdataene fra vildtype- og mutantlinjer på hvert tidspunkt ved hjælp af uparret T-test og envejs ANOVA for at sammenligne midlerne til det specifikke interessepunkt. For at sammenligne middelværdierne på tværs af alle tidspunkterne skal du udføre flere T-tests mellem vildtype- og mutantlinjer på tværs af flere tidspunkter. Pollenhydratiseringstidsseriedataene for vildtypeplanter indsamlet på forskellige dage viste, at minimums- og maksimumsværdierne for middelværdierne mellem replikater for alle tidspunkter var inden for 3%Disse repræsentative data for vildtypebestøvninger viste en høj grad af konsistens for relativt lave prøveantal og på tværs af forskellige dage.
